サービス

プロフェッショナルでコスト削減のソリューション

サイト特異的変異導入のためのエクスプレッションベクターへのクローン化

クリエイティブ酵素 提供する エクスプレッションベクターへのクローン化 献身的な サイト特異的変異導入(SDM)のための上流サービス ワークフロー。当社のクローン作成サービスは、合成または検証された遺伝子が最適化された発現システムに正確に挿入されることを保証し、正確な変異誘発および下流のタンパク質生産の基盤を確立します。高忠実度のクローン戦略、先進的なベクターデザイン、および厳密な配列検証を使用して、互換性、効率性、および再現性を保証します。単一の変異体を生成することが目的であれ、広範なバリアントライブラリを作成することが目的であれ、当社のクローン専門知識は設計から機能的発現へのシームレスな移行を確実にします。

遺伝子クローニング:SDMにおける重要かつ正確なステップ

効率的かつ正確な遺伝子クローニングは、酵素工学や標的指向変異導入(SDM)プロジェクトの成功に不可欠です。最適化されていないベクター、意図しない変異、または最適でないプロモーターは、発現収量、折りたたみ効率、および実験の再現性を損なう可能性があります。したがって、変異に対応できる発現構築体を確立することは、SDM手法を行う前の重要な初期ステップです。

ワークフローは 発現ベクターへのクローニング 酵素工学における標的変異導入(SDM)は、基本的かつ精密なプロセスです。これにより、作成した変異遺伝子が宿主細胞(例えば、)に導入可能なベクターに配置されることが保証されます。 大腸菌変異タンパク質を大量に生成して分析するため。

クリエイティブエンザイムズでは、ターゲット酵素と発現ホストに合わせた包括的なベクタークローニングサービスを提供しています。私たちの技術チームは統合します。 バイオインフォマティクス解析、配列最適化、クローニング設計 あなたの変異誘発戦略と互換性があるだけでなく、細菌、酵母、昆虫、または哺乳類系での発現に最適化された構造を作成すること。

A simplified workflow of a site-directed mutagenesis strategy involves gene cloning after template DNA sequencing and gene synthesis図1. サイト指向変異導入戦略。テンプレートDNAを準備し、変異を合成した後、変異準備が整った発現構築体が作成される。 他者., 2003)

提供するもの

サイト特異的変異導入のための遺伝子クローニングには以下が含まれます:

カスタムベクター構築

テーラーメイドのデザインとクローン作成のための 大腸菌酵母、昆虫、または哺乳類システムを用いて多様なSDMアプリケーションをサポートします。

複数のクローン戦略

制限酵素クローニング、シームレスクローニング、ギブソンアセンブリー、特異的組換えを含みます。

ベクトル最適化

発現と互換性を最大化するためのカスタマイズ可能なプロモーター、選択マーカー、および融合タグ。

合成遺伝子または既存遺伝子の挿入

検証済みまたは新たに合成された遺伝子を事前に検証された発現ベクターに統合すること。

配列確認と品質管理

コロニーPCR、制限酵素消化、全長サンガーシーケンシングを用いた包括的な構築検証。

使用可能なプラスミド

高純度で変異対応のプラスミド、シーケンシングレポートと注釈付きベクターマップが付属しています。

オプショナルライブラリの構築

酵素バリアントスクリーニングのための組み合わせまたは多地点変異導入ライブラリの高スループット生成。

ベクトルマップの注釈とドキュメント

将来の実験における明確なトレーサビリティとデータ統合のための詳細な出版準備が整った地図と配列注釈。

サービスワークフロー

Service workflow of cloning into expression vectors for site-directed mutagenesis

サービスの詳細

パラメーター 仕様
クローン技術 制限酵素クローニング、シームレスクローニング、ギブソンアセンブリー、特異的組換え
ホストシステム 大腸菌バチルスピキア昆虫、哺乳類
ベクトルオプション 標準またはカスタム、タグ/プロモーション/マーカーの柔軟性付き
挿入サイズ 最大10KB(リクエストに応じて大きなサイズも可能)
QC手法 サンガーシーケンシング、制限酵素消化、コロニーPCR
成果物 検証済みプラスミドDNA(≥2 µg)、配列解析報告書、注釈付きベクターマップ

遺伝子クローニング前の関連サービス

これ サイト特異的変異導入のためのエクスプレッションベクターへのクローン化 サービスは私たちの包括的な一部です。 サイト特異的変異導入のための上流サービス、これには次も含まれます:

これらの統合サービスは、成功する突然変異誘発および酵素工学プロジェクトのための堅牢で正確、かつ完全に検証された出発点を保証します。

私たちのチームにお問い合わせください

なぜ私たちを選ぶのか

包括的なベクターポートフォリオ

さまざまな宿主や用途に適した幅広い発現ベクターへのアクセス。

高精度クローン作成

不要な変異やフレームシフトなしでのインサートのシームレスな統合。

保証された互換性

突然変異誘発および発現に直接使用するために検証された構築物。

柔軟なデザインオプション

カスタマイズ可能なプロモーター、フュージョンタグ、選択マーカー。

すべてのステップでの品質保証

完全な配列検証と機能的完全性テスト。

上流サービスとの統合

当社の遺伝子合成およびシーケンシングサービスと完全に互換性があり、効率的なワークフローを実現します。

ケーススタディ

ケース1:発現向上のための最適化クローン作成 バチルス

クライアントのニーズ:

バイオテクノロジー企業は、工業的なバイオマス分解効率を向上させるために、部位特異的変異導入(SDM)を通じて熱安定性のあるキシラナーゼを設計しようとしました。しかし、彼らの初期の構造体は、十分に発現しませんでした。 バチルス・サブチリス、おそらく互換性の問題によるものです。 大腸菌ベースの発現ベクターと バチルス 転写機構。低い酵素収率がその後の突然変異誘発および動力学スクリーニングを妨げた。

私たちのアプローチ:

私たちは全体のクローンフレームワークを再設計しました。特に調整されたコドン最適化されたキシラナーゼ遺伝子を合成しました。 B. サブチリス それをサブクローニングして、aに挿入しました。 バチルス 強力な構成的プロモーターと分泌用のネイティブシグナルペプチドを備えたシャトルベクター。クローニング戦略は、配列決定および小規模発現テストを通じて検証されました。

結果:

最適化された構造は、可溶性酵素の収率を6.3倍増加させ、強固な分泌効率を実現しました。このブレークスルーにより、高スループットのSDMスクリーニングが可能となり、いくつかの熱安定性変異体が特定され、その後、再現可能な活性プロファイルでパイロット発酵において成功裏にスケールアップされました。

ケース2:酵素最適化のためのマルチサイト突然変異ライブラリクローニング

クライアントのニーズ:

大学の研究グループは、脱水素酵素の触媒メカニズムを探求することを目的として、活性部位周辺に複数の点変異を導入しました。従来の単一変異体クローニングは遅く、組換えエラーが発生しやすいため、機能スクリーニングのタイムラインが遅延しました。

私たちのアプローチ:

我々は、Gibson Assemblyを用いたモジュラーな高スループットクローニング戦略を実施しました。変異に対応可能な合成遺伝子フラグメントを設計し、T7プロモーター下の高コピーpETベクターに組み込みました。各バリアントは自動液体ハンドリングシステムを使用して並行して構築され、すべてのプラスミドは発現前に配列確認されました。

結果:

クライアントは、3週間以内に96種類の正しく組み立てられたバリアントの完全なライブラリを取得しました。これは、予想されるプロジェクトの期間の半分未満です。高スループット発現と動的スクリーニングにより、触媒効率が最大2.8倍向上した複数の変異体が特定されました。このモジュラー設計は、今後の酵素工学研究のための再利用可能なプラットフォームとして機能しています。

よくある質問

  • Q: カスタムまたは専用ベクトルにクローンできますか?

    A: はい。クライアントが提供するベクターを使用することも、あなたの突然変異誘発ワークフローに適した完全にカスタムのバックボーンを設計することもできます。
  • Q: 挿入配列やベクターに複雑な配列(例:高GC含量や繰り返し配列)が含まれている場合はどうなりますか?

    A: 私たちのチームは、難しい配列を高い忠実度で扱うために、最適化されたクローン戦略と特化したポリメラーゼを使用しています。
  • Q: 一つのクローニングステップで複数の変異を組み合わせることはできますか?

    A: はい。モジュラークローニングやギブソンアセンブリを通じて、複数の部位変異を同時に導入することができ、高スループットの変異体生成が可能です。
  • Q: どの発現系がサポートされていますか?

    A: 私たちは、以下を含む幅広いホストをサポートしています。 大腸菌バチルスピチア・パストリス昆虫細胞および哺乳類細胞。
  • Q: 成功したクローン作成をどのように確認しますか?

    A: 各構築物は、納品前にコロニーPCR、制限酵素消化、およびフルレングスのサンガーシーケンシングによって検証されます。
  • このサービスは、私の下流の突然変異導入または発現ワークフローと直接統合できますか?

    A: もちろんです。私たちのクローン作成サービスは、SDMおよびタンパク質発現・精製サービスとシームレスに統合されるように設計されており、遺伝子から機能までの統一されたパイプラインを提供します。

参照:

  1. Allemandou F, Nussberger J, Brunner HR, Brakch N. プラスミドテンプレートを再現する2つのPCR生成DNA断片を用いた迅速なサイト特異的変異導入。 バイオメドリサーチインターナショナル2003;2003(3):202-207. doi:10.1155/S1110724303209141

研究および産業用途にのみご使用ください。個人医療用途には適していません。一部の食品グレード製品は、食品および関連用途における処方開発に適しています。

サービス
オンラインお問い合わせ

研究および産業用途にのみご使用ください。個人医療用途には適していません。一部の食品グレード製品は、食品および関連用途における処方開発に適しています。