酵素の回収と再折りたたみ

クリエイティブエンザイムズは、数多くの酵素の開発、製造、テストにおいてリーダーです。すべての産業および学術顧客向けに、多くの高度な酵素発現および特に顧客指向の酵素精製サービスが利用可能です。私たちは、ターゲット酵素の精製のために完全にカスタマイズされたサービスを提供します。精製後の回収と再折りたたみは、クリエイティブエンザイムズのユニークなサービスの一つであり、全体的な発現収率を大幅に改善する重要な部分です。

組換え酵素発現技術は広く使用されています。異種遺伝子発現は一般的にインクルージョンボディの生成につながります。インクルージョンボディのような変性状態から酵素を元の構造に再折りたたむことは、活性酵素の回収中の制限要因です。酵素の凝集は一般的な現象であり、低い回収率をもたらします。クリエイティブエンザイムズは、正しい再折りたたみを達成するためにいくつかの技術を使用しています：

• 直接希釈

最も簡単な酵素再折りたたみ法は、濃縮された酵素-変性剤溶液を酵素の元の構造の形成を可能にする再折りたたみバッファーに希釈することです。実験室規模では理想的ですが、この方法はスケールアップ時に深刻な欠点があり、再構成後に巨大な再折りたたみ容器と追加のコストのかかる濃縮ステップが必要です。

図1: 正しい折りたたみと誤った折りたたみおよび凝集の簡略化モデル。正しい酵素折りたたみ経路（1として示される）は、誤った折りたたみ（2として示される）や凝集（3として示される）としばしば競合します。青い線はタンパク質の親水性溶媒にさらされた部分を示し、赤い線は疎水性の部分を示します。
参考文献: Vallejo F L, Rinas U. 微生物細胞工場, 2004, 3(1):1-12.

• 透析

透析では、化学的に変性された酵素が再折りたたまれ、変性剤濃度を十分に減少させ、酵素の再折りたたみを可能にします。一段階透析は操作が簡単です。しかし、この方法は時々大規模な操作には適していません。

図2: 変性タンパク質溶液から変性剤を除去するための2種類の透析法の模式図。一段階透析では、タンパク質周囲の変性剤濃度が拡散を通じて急速に減少し、凝集体が形成されます。段階的透析では、変性タンパク質からの変性剤の段階的除去が行われます。
参考文献: Yamaguchi H, Miyazaki M. バイオ分子, 2014, 4(1):235-251.

• 酵素再折りたたみのためのクロマトグラフィー法

a. 吸着クロマトグラフィー (SEC, HIC, IEC, IMAC)
変性酵素の媒体への吸着は、酵素分子間の非特異的相互作用を効果的に抑制し、酵素の再折りたたみ速度を改善します。この方法は高効率で、時間を節約でき、リサイクル可能です。

b. ゲル濾過クロマトグラフィー
分子ふるい効果により、酵素と小分子変性剤を分離し、溶液交換と酵素の再折りたたみを実現します。この方法は、一段階の自動化された酵素再折りたたみと精製を達成します。

c. 固定化シャペロン/フォルダーによるクロマトグラフィー再折りたたみ
媒体上の固定化シャペロンまたはフォルダーは、クロマトグラフィーコラムを折りたたみ反応器にします。

• ミセルおよびリポソームを用いた酵素再折りたたみ支援システム

界面活性剤とリン脂質は、それぞれミセルとリポソームの形で、タンパク質の再折りたたみを助ける可能性を示しています。酵素分子は逆ミセルに包まれ、酵素の折りたたみ過程での凝集を減少させ、変性剤の濃度を徐々に減少させ、REDOXに参加することで、変性酵素が再折りたたまれます。

• 水性二相系 (ATPS)

水性二相系 (ATPS) は、活性酵素の回収に成功裏に使用されてきました。ATPSは、インクルージョンボディの溶解と酵素の再折りたたみを一段階で完了させます。

• 高水圧による再折りたたみ

高圧は凝集体を溶解させ、元の酵素構造を促進します。この方法には多くの利点があります：溶解と酵素の再折りたたみを同時に行うことができ、酵素濃度に依存せず、酵素を迅速に解聚および再折りたたみます。

生物学的に活性な酵素の回収は、酵素の構造と機能の分析だけでなく、治療薬や産業プロセスの開発においても重要な目標です。しかし、酵素の折りたたみは、イオン強度、pH、温度、酸化状態、酵素濃度、疎水性、極性、カオトロピック剤および他のタンパク質の存在など、さまざまな物理化学的パラメータに影響されるため、すべての酵素に対する普遍的な再折りたたみレシピは存在しません。特定の酵素に対して、完璧な再折りたたみ条件は個別に決定する必要があります。クリエイティブエンザイムズは、酵素再折りたたみの課題を解決する豊富な経験を持っています。最先端の施設と業界をリードする技術的専門知識を通じて、私たちは顧客に革新的でカスタマイズされた酵素回収および再折りたたみサービスを提供します。