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直交tRNA/aaRSペアの工学

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工学的に直交tRNAおよびアミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）ペアを設計することは、部位特異的な技術を可能にする基盤技術です。 非天然アミノ酸（uAA）の組み込み タンパク質に変換されます。直交ペアは宿主の翻訳機構とは独立して機能し、選択されたコドンのみが再割り当てされ、ターゲットの非標準アミノ酸（uAA）のみが認識されて充填されることを保証します。 クリエイティブ酵素 高忠実度、低バックグラウンド抑制、微生物、真核生物、細胞フリー発現システム全体での堅牢なパフォーマンスを最適化した完全にカスタマイズされた直交tRNA/aaRSペアを設計、エンジニアリング、検証するエンドツーエンドプラットフォームを提供します。高度な構造工学、指向進化、および厳密なスクリーニング手法を通じて、希望するuAA、発現ホスト、およびアプリケーションに合わせた高精度の直交システムを提供します。

直交tRNA/aaRSペアのエンジニアリングに関する背景

直交翻訳コンポーネントの必要性

非自然アミノ酸の取り込みは、自然なアミノアシル化経路を回避しつつ、リボソーム機構とシームレスに相互作用できる翻訳成分を必要とします。内因性tRNAおよびaaRSは非常に特異的な認識パターンを維持するために共進化しているため、遺伝コードを拡張するには、天然の合成酵素や天然のtRNA基質と相互作用しないシステムが必要です。これらのエンジニアリングされたシステムは次の条件を満たさなければなりません：

  • 指定されたコドン（通常はストップコドンまたは拡張コドン）を認識する
  • 希望するuAAのみを充電してください。
  • 自然アミノ酸の充電を避ける
  • 内因性合成酵素による誤請求を避ける
  • 細胞ストレスを引き起こすことなく、十分な発現レベルで機能する

直交tRNA/aaRSペアは、新しいコドンを読み取り、新しい化学機能をタンパク質に組み込むことができる平行翻訳回路を提供することで、これらの要件を満たします。

直交ツールの起源と進化

初期の直交系は、自然に低い交差反応性を示す古細菌および細菌の合成酵素から適応されました。時間が経つにつれて、研究者たちは以下のような洗練された工学的アプローチを開発しました：

  • アイデンティティ要素の再プログラミング（tRNA認識の変更のために）
  • 活性部位のリモデリング（uAA特異的aaRSの作成のため）
  • ループエンジニアリングとドメインスワッピング
  • ネガティブおよびポジティブ選択スキーム
  • 連続的または反復的な指向進化
  • 基質ドッキングの計算モデル化

今日、工学的に設計された直交ペアは広く使用されています。 タンパク質工学、 機械的酵素学構造生物学、治療設計、材料科学、合成生物学。

Orthogonal tRNA for genetic code expansion図1. 遺伝コードの拡張における基本要素としての直交tRNA。 (キム) 他者., 2024)

私たちが提供するもの

クリエイティブエンザイムズでは、オルソゴナルtRNA/aaRSペアのカスタマイズエンジニアリングのための包括的なプラットフォームを提供しています。私たちのサービスには以下が含まれます：

完全直交tRNA/aaRSペアの工学

私たちは、次のような直交ペアを開発します：

  • 宿主の内因性合成酵素と交差反応しないでください。
  • ネイティブtRNAを充電したりデコードしたりしないでください。
  • 選択されたホスト内で構造的安定性と効率的な折りたたみを維持する
  • 高発現システムにおいても優れたパフォーマンスを発揮する

私たちの直交セットは利用可能です。 大腸菌酵母、哺乳類宿主（HEK293、CHO）、および細胞フリーシステム。

aaRSのためのuAA特異的活性部位工学

私たちは、あなたのターゲットuAAに合わせてaaRS触媒ポケットを調整します。

  • 合理的な構造設計
  • 活性部位トンネルの再形成
  • 基質ポケットの拡張または収縮
  • 静電気的および水素結合ネットワークの再設計
  • 劇的に改善された特異性のための指向性進化

tRNAアイデンティティ要素の最適化

直交性と効率的なデコードを確保するために：

  • 主要なtRNAアイデンティティ要素（受容体ステム、Dループ、アンチコドンループ、可変アーム）が再設計されました。
  • ホスト特有の処理信号が最適化されています。
  • プロモーターと発現カセットは、バランスの取れたtRNAの豊富さのために設計されています。

宿主特異的適応

私たちは、次のために直交ペアをカスタマイズします：

  • 特定の生物における最適なパフォーマンス
  • 内因性tRNAによる競争の減少
  • 熱的または酸化的ストレス条件下での安定化折りたたみ
  • 改善された核輸出と細胞質局在（哺乳類システム）
  • 低酸素または高密度発酵環境におけるパフォーマンスの向上

高度なポジティブ/ネガティブ選択スクリーニング

私たちのスクリーニングパイプラインは次のものを使用しています：

  • ハイスループット蛍光または生存ベースのスクリーニング
  • 高忠実度バリアントを分離するための二重選択システム
  • MSベースの真の組み込みの検証
  • 包括的なライブラリー分析のための高スループットシーケンシング

検証、スケーラビリティ、技術移転

各エンジニアリングされたペアは次のように進行します：

  • LC–MS/MSによる組み込みの検証
  • 忠実度と誤請求分析
  • さまざまな条件下での抑制と発現の調整
  • 最終配列、構造体、プロトコル、およびパフォーマンスレポートの納品。

特殊なuAAのためのエンジニアリング

私たちは以下の特徴を持つuAAの組み込みをサポートします：

  • 光活性化グループ（ベンゾフェノン、ジアジリン）
  • 化学選択的ハンドル（アジ化物、アルキン、ストレインサイクロオクチン）
  • 蛍光色素と溶媒クロミック染料
  • 翻訳後修飾模倣体（ホスホセリン類似体、スルフォチロシン）
  • 金属イオン結合リガンド
  • 分光学アプリケーションのための電気活性または光活性の官能基

各化学クラスは独自の工学的課題を提示し、私たちはそれに対して特定の構造的および進化的戦略を通じて対処しています。

コドン再割り当て戦略

私たちは、次のものと互換性のある直交ペアを提供します：

  • アンバー（TAG）抑制、最も広く使用されている方法
  • マルチプレクシングアプリケーションのためのオパール（TGA）およびオーカー（TAA）抑制
  • 四重コドンデコーディングによる複数の非標準アミノ酸の同時導入
  • ゼロバックグラウンド抑制のためのゲノム再コーディング生物

忠実性と品質管理

私たちの品質管理パイプラインは次のことを評価します：

  • uAA組み込みの忠実度（ほとんどのデザインで95％以上）
  • 競合アミノ酸の誤取り込み率
  • 抑制効率と翻訳スループット
  • 宿主生理への影響
  • 長期的な発現安定性

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サービスワークフロー

Service workflow for orthogonal tRNA/aaRS pairs engineering

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なぜ私たちを選ぶのか

直交翻訳工学の深い専門知識

私たちのエンジニアは、遺伝子コードの拡張において数十年の経験を持っており、私たちはその分野で能力を持つ数少ない提供者の一つです。 デノボ 直交対生成。

厳格なスクリーニングによる最高の忠実度

デュアルセレクションシステムと高解像度分析ツールにより、比類のない基質特異性と最小限のバックグラウンドノイズを達成することができます。

すべての表現プラットフォームにおけるカスタムソリューション

微生物、酵母、哺乳類細胞、または細胞フリー環境で作業しているかどうかにかかわらず、私たちのシステムはあなたの正確なコンテキストに合わせて設計され、検証されています。

高度な計算と実験の統合

私たちは、構造モデリング、ドッキングシミュレーション、そして指向性進化を統合して、発見を加速し、精度を最大化します。

コンセプトからアプリケーションまでのエンドツーエンドサポート

クライアントは、実現可能性評価、エンジニアリング、検証、そして下流のタンパク質生産の各段階でガイダンスを受けます。

信頼性が高く、高再現性のシステム

すべての直交ペアは、一貫したパフォーマンスのためにベンチマークされており、あなたのラボでのシームレスな導入を確保するための詳細な文書が用意されています。

ケーススタディと実践的な洞察

ケース1：非自然アミノ酸導入のための直交プロリルtRNA合成酵素/tRNAペアの工学

遺伝コードを拡張するために、研究者たちは古代の祖先からの相互に直交するプロリンtRNA/プロリンtRNA合成酵素（ProRS）ペアを設計しました。 大腸菌アンチコドン結合ポケットを再設計することによって ピロコッカス・ホリコシイ ProRSは、選択的に認識する合成酵素を作成しました。 アルケオグロブス・フルギダス CUA、AGGG、またはCUAGアンチコドンを持つtRNAバリアント。一部のエンジニアリングされた合成酵素は厳密な特異性を示しましたが、他のものはより柔軟でした。さらなる最適化により、アンバー抑制効率が大幅に向上したtRNAが得られました。この直交ペアは、プロリン類似体や他のN修飾された非天然アミノ酸の部位特異的導入を可能にし、tRNA–aaRSインターフェースの適応性を示し、生細胞における多重UAA導入への道を開きます。

Evolution of multiple, mutually orthogonal prolyl-tRNA synthetase/tRNA pairs for unnatural amino acid mutagenesis in Escherichia coli図2. 高効率のアンバーサプレッサー、Af-tRNAの進化CUAプロ(A) Af-tRNAのハイライトされたセグメントCUAプロ ランダム化されました。示された変異を取り入れた非常に効率的な変異体、Af-tRNACUAプロ-h8が特定されました。(B) 野生型およびh8 Af-tRNAの抑制活性CUAプロ(C) pEvol-Proを使用して、元の（野生型）または進化したh8-tRNAをコードするGFP-Tyr151TAGの発現レベル。 (Chatterjee) 他の著者., 2012)

ケース2：センスコドンの再割り当てのためのピロリシルtRNA/aaRSの指向性進化

遺伝コードの柔軟性を拡張するために、研究者たちは非常に効率的なものを進化させました。 メタノサルキナ・バルケリ チロシンを活性化し取り込むことができるピロロシルtRNA/aaRSペア。このエンジニアリングされたペアは、アンバーコドンを再割り当てします。 大腸菌 約98%の効率で、広く使用されているものと同等です。 メタノカルドコッカス・ジャナスキィ システム。蛍光ベースのスクリーニングを使用して、新しいペアのセンスコドンを再割り当てする能力が体系的にテストされました。比較により、間の明確なコドンの好みが明らかになりました。 M. バルケリ と M. jannaschii システムは、異なる直交ペアが遺伝コードの異なる位置で優れていることを示しています。この研究は、再割り当てに最も許容されるコドンを特定することにより、複数のサイトでのncAA導入のための強力なプラットフォームを提供します。

Directed evolution of the Methanosarcina barkeri pyrrolysyl tRNA/aminoacyl tRNA synthetase pair for rapid evaluation of sense codon reassignment potential図3. 指向性進化の メタノサルキナ・バルケリ ピロリシルtRNA/アミノアシルtRNA合成酵素ペアによるセンスコドン再割り当ての可能性の迅速評価 (シュヴァルク) 他者., 2021)

FAQ: 直交tRNA/aaRSペアのエンジニアリング

  • Q: 完全に新しい人工アミノ酸のための直交ペアを設計できますか？

    A: はい。適切な構造的または化学的情報があれば、全く新しいアミノ酸の化学を認識できる合成酵素を設計または進化させることができます。私たちのワークフローは、計算モデリング、活性部位の再設計、および反復スクリーニングを統合して、高い選択性と効率的なチャージを確立します。非常に珍しい基質に対しては、触媒の回転を維持し、誤アシル化を最小限に抑えながら、立体的または電子的特徴に対応するために周囲の残基を修正することもできます。

  • Q: 異なるuAAの多重組み込みのために、複数の直交ペアを設計できますか？

    A: もちろんです。私たちは、独立した直交tRNA/aaRSシステム、ユニークなコドン（例：UAG、UGA、四重コドン）、および宿主適応型抑制フレームワークを組み合わせることで、二重および三重uAA導入戦略を定期的にサポートしています。各コンポーネントは、同じタンパク質内での複数のuAAの同時かつ干渉のない導入を確保するために、互換性および交差反応性テストを受けます。

  • Q: あなたのエンジニアリングシステムに適合する宿主生物は何ですか？

    A: 私たちのプラットフォームは、さまざまな分野で検証されています。 大腸菌、 サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、 ピキア株昆虫細胞、HEK293、CHO、およびさまざまな細胞フリー発現システム。必要に応じて、発現要素を調整したり、tRNA構造を変更したり、合成酵素の特異性を再最適化することで、あまり一般的でない微生物や独自の産業株に対して直交ペアを適応させることができます。

  • Q: エンジニアリングされた翻訳コンポーネントとネイティブ翻訳コンポーネントの間で真の直交性をどのように確保しますか？

    A: 我々は、内因性tRNAにアミノ酸を付加する合成酵素の変異体を排除するためのネガティブセレクションを含む多層戦略を使用し、認識モチーフを再構築するための構造工学、およびホスト特異的な検証アッセイを行っています。これにより、設計された合成酵素が意図したtRNAパートナーにのみアミノ酸を付加し、直交tRNAが天然のaaRS酵素によって影響を受けないことが保証されます。最終的なシステムは、安定性と忠実性を確認するために、基底および誘導発現条件下でテストされます。

  • Q: 下流のタンパク質発現、精製、検証サポートを提供していますか？

    はい。私たちは、発現最適化、精製タンパク質の供給、組み込み忠実度の分析、活性または構造の特性評価など、包括的な下流サービスを提供しています。自ら発現を行う予定のクライアントには、最適化された構築設計、推奨される誘導パラメータ、およびトラブルシューティングのガイダンスも提供しています。

  • Q: 構造モデリングを提供していますか、それとも インシリコ 予測？

    A: 我々はそうします。複雑なプロジェクトでは、分子ドッキング、活性部位モデリング、コドンコンテキスト予測を統合して、aaRSの設計を導き、ベンチフェーズに入る前に成功率を向上させます。

参照文献：

  1. チャッタジー A、シャオ H、シュルツ PG。非自然アミノ酸突然変異のための複数の相互に直交するプロリルtRNA合成酵素/tRNAペアの進化 大腸菌。 米国科学アカデミー紀要2012;109(37):14841-14846. doi:10.1073/pnas.1212454109
  2. キムY、チョS、キムJC、パクHS。遺伝子コード拡張のためのtRNA工学戦略。 フロントジェネティクス2024年;15:1373250. doi:10.3389/fgene.2024.1373250
  3. シュワルクDG、シュミットMA、フィスクJD。指向性進化の メタノサルキナ・バルケリ ピロリシルtRNA/アミノアシルtRNA合成酵素ペアによるセンスコドン再割り当ての可能性の迅速評価。 IJMS2021;22(2):895。doi:10.3390/ijms22020895
オンラインお問い合わせ

研究および産業用途にのみご使用ください。個人医療用途には適していません。一部の食品グレード製品は、食品および関連用途における処方開発に適しています。

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