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プロフェッショナルでコスト削減のソリューション

その他の細菌宿主における酵素発現システム

Creative Enzymesは、従来のE. coliおよびBacillusシステムにとどまらず、特殊な細菌宿主を用いた高度な酵素発現・生産サービスを提供しています。当社プラットフォームは、Lactococcus lactisPseudomonas fluorescensStreptomyces lividansStaphylococcus carnosusを含む、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の幅広い菌種に対応可能です。エンドトキシンフリー分泌、強力な細胞外生産、高収量タンパク質分泌といった宿主特異的な利点を活用し、Creative Enzymesは、遺伝子最適化、ベクターデザイン、発酵、下流工程(DSP)、精製までを網羅する、研究用途および産業用途向けのフルカスタマイズソリューションを提供します。

背景:酵素発現における代替細菌宿主の台頭

E. coliおよびBacillusは依然として主要な細菌発現系ですが、従来宿主が不適となるケースも存在します。例えば、タンパク質が凝集しやすい、エンドトキシン混入が許容されない、分泌効率が低い、といった状況です。代替細菌宿主は、これらの課題に対して最適化された解決策を提供します。

  • Lactococcus lactis:効率的な分泌能を有し、封入体形成が少なく、エンドトキシンフリーのプロファイルを持つGRAS微生物。治療用、食品用、化粧品用酵素に適しています。
  • Pseudomonas:高度な分泌システムを備え、酸素制限に対する感受性が低い、増殖の速いグラム陰性菌。P. fluorescensおよびP. putidaは、代謝副産物を最小限に抑えつつ高収量生産が可能です。
  • Streptomyces lividans:可溶性酵素を培地中へ直接分泌することで知られる糸状性グラム陽性宿主で、下流精製の簡素化に寄与します。
  • Staphylococcus carnosus:非病原性で高い分泌能を有するグラム陽性菌であり、複雑な可溶化およびリフォールディング(再生)工程の必要性を低減します。
  • Ralstonia eutropha:封入体形成が抑制され、発現困難な酵素に対して高い発現ポテンシャルを有する新興宿主です。

複数の宿主プラットフォームを提供することで、Creative Enzymesは、研究・パイロットスケール・産業要件に応じたケース別の酵素発現および機能最適化を可能にします。

提供内容:代替細菌宿主にまたがる包括的ソリューション

Creative Enzymesは、多様な代替細菌宿主のポートフォリオを活用し、遺伝子から製品化までの一貫サービス、またはプロジェクトの選択セグメントに対するサービスを提供します。

専門宿主

  • Lactococcus lactisによる酵素発現:治療用および食品グレード酵素に適した、高効率・エンドトキシンフリー・GRAS準拠の分泌発現。
  • Pseudomonasベースの酵素発現:迅速な増殖と強固な分泌能を備えたグラム陰性宿主による高収量発現。
  • Streptomycesベースの酵素生産:産業用途向けの高容量な可溶性タンパク質分泌生産。
  • Staphylococcus carnosus発現システム:細胞外タンパク質生産に適した、非病原性かつ高効率分泌。

カスタム対応サービスモジュール

モジュール 詳細
遺伝子設計および宿主特異的最適化
  • コドン最適化、mRNA安定性、GC含量の調整
  • 阻害モチーフの除去および制御配列の導入
発現ベクターデザイン
  • 強力で宿主適合性の高いプロモーター
  • マルチコピー統合またはプラスミドベース発現
  • 精製または検出のためのタグ付加オプション
宿主株の選定およびエンジニアリング
  • プロテアーゼ欠損株または胞子形成欠損株
  • 食品用または治療用酵素向けのGRAS認証株
  • 発現困難タンパク質に対応する遺伝子改変株
分泌および安定性の向上
  • シグナルペプチドの選定および最適化
  • グラム陽性宿主におけるSec/Tat経路のエンジニアリング
  • フォールダーゼまたはシャペロンとの共発現
発酵プロセス開発
  • シェイクフラスコスクリーニングおよびバイオリアクターへのスケールアップ
  • 栄養供給、溶存酸素制御、pH最適化
  • 各宿主に適合した高密度発酵
下流工程(DSP)および精製
  • 細胞除去および培地清澄化
  • クロマトグラフィー精製
  • タンパク質製剤化および安定性試験
分析特性評価および品質管理(QC)
  • 酵素活性アッセイおよび速度論解析
  • SDS-PAGE、ウエスタンブロッティング、質量分析
  • 熱安定性およびpH安定性評価

お問い合わせ

選ばれる理由:代替細菌発現におけるCreative Enzymesの強み

宿主横断の豊富な専門知見

研究用途および産業用途におけるグラム陽性・陰性細菌システムの数十年にわたる実績。

カスタマイズ可能な発現ソリューション

プロジェクト固有の収量、純度、機能要件に合わせた遺伝子・ベクター・宿主の最適な組合せを設計。

高度な分泌・安定性エンジニアリング

シグナルペプチドスクリーニング、シャペロン共発現、宿主改変により、可溶性かつ活性を有する酵素生産を最大化。

パイロットから産業スケールまでの発酵対応

シェイクフラスコ試験からバイオリアクタースケールアップまで、再現性の高いプロセス開発を包括的に実施。

統合型の下流工程(DSP)

複数宿主における分泌発現および細胞内発現の双方に適合する、効率的な精製・製剤化戦略。

規制および安全性コンプライアンス

治療、食品、化粧品用途に適した、GRAS認証宿主およびエンドトキシンフリーシステム。

事例:代替細菌宿主の代表的な適用例

事例1:Streptomycesにおける耐熱性ペルニシンの異種生産

超好熱性古細菌Aeropyrum pernix由来の耐熱性セリンプロテアーゼであるペルニシンは、Streptomyces rimosusシステムにおいて発現に成功しました。srTシグナル配列および機能的切断モチーフを融合したコドン最適化遺伝子コンストラクトにより、追加の活性化工程を要することなく、完全に活性を有する酵素の細胞外分泌が可能となりました。生化学的解析により、組換え酵素がウシプリオンタンパク質の分解能を含む、天然型の特性をすべて保持していることが確認されました。本アプローチは、Streptomyces宿主が、下流工程を簡素化し実用化を促進する、産業スケールでの発現困難な好熱性酵素の異種発現に有効であることを示しています。

Extracellular production of the engineered thermostable protease pernisine from Aeropyrum pernix K1 in Streptomyces rimosus図1.プラスミドコンストラクトpVFPER5で形質転換したS. rimosus形質転換体が産生した、単離・精製済みコドン最適化ペルニシンの解析。SDS-PAGE(a)およびザイモグラフィー(b)を使用。レーン0:分子量マーカー(左に表示);レーン1:細胞溶解画分;レーン2:Ni–NTAクロマトグラフィー画分;レーン3:調製用ゲルろ過カラム画分;レーン4:透析後のコドン最適化ペルニシン画分。(Šnajder et al., 2019)

事例2:Lactococcus lactisにおける胆汁酸塩加水分解酵素の食品グレード発現

本研究では、Lactococcus lactisのNICEシステムを用い、Lactobacillus plantarum由来の胆汁酸塩加水分解酵素(BSH、EC 3.5.1.24)を細胞内および細胞外で発現させる食品グレードシステムを確立しました。L. lactisのコドン使用バイアスに基づくコドン最適化により、細胞内および細胞外のBSH活性はそれぞれ12倍および9.5%向上しました。合成プロペプチドをSPusp45に融合したところ、酸性プロペプチドは分泌効率および収量を有意に改善した一方、中性ペプチドは影響がなく、塩基性ペプチドは細胞外発現を低下させました。コドン最適化と酸性プロペプチドの組合せにより、細胞外活性は11.3%増加し、3.56 U/mgに到達しました。本成果は、食品グレードでのBSHの細胞内・細胞外発現に関する初の報告であり、L. lactisにおけるBSHおよび他の異種タンパク質のスケーラブルな生産を支持するものです。

Codon and propeptide optimizations to improve the food-grade expression of bile salt hydrolase in Lactococcus lactis図2.異なる細菌におけるBSHの細胞内および細胞外発現のSDS-PAGE解析。(a)および(b):異なるプラスミドを含む組換えL. lactis NZ3900の全細胞タンパク質;(c):異なる発現ベクターを保持する組換えL. lactis NZ3900の上清中タンパク質。(Dong et al., 2015)

FAQ:その他の細菌宿主における酵素発現・生産

  • Q:E. coliやBacillusではなく、代替細菌宿主を検討すべきなのはどのような場合ですか?

    A:細胞外分泌が望ましい場合、封入体を回避する必要がある場合、エンドトキシンフリー製品が要求される場合、または宿主特性(例:グラム陽性菌の分泌効率)により優位性が得られる場合に、代替宿主が推奨されます。
  • Q:これらの宿主は食品用途および治療用途に適していますか?

    A:はい。Lactococcus lactisおよびStaphylococcus carnosusはGRAS認証を受けており、エンドトキシンフリーであるため、治療用途および食品グレード酵素生産の双方に適しています。
  • Q:これらの宿主で高密度発酵は可能ですか?

    A:はい。Pseudomonas属およびStreptomycesシステムは、パイロットおよび産業スケールの発酵に適合し、高収量・高生産性を達成できます。
  • Q:これらのシステムでは、タンパク質の安定性はどのように担保されますか?

    A:Creative Enzymesでは、シグナルペプチド最適化、フォールダーゼ/シャペロンの共発現、発酵条件の制御など、宿主特異的戦略を適用し、酵素活性と可溶性の維持を図ります。
  • Q:精製および下流工程は簡素化されますか?

    A:はい。細胞外分泌が可能な宿主(例:LactococcusStreptomycesS. carnosus)では、可溶化やリフォールディングの必要性が低減され、回収および精製が簡素化されます。
  • Q:一般的なプロジェクト期間はどの程度ですか?

    A:酵素および宿主の複雑性に依存しますが、通常、コンストラクト設計から精製酵素の納品まで数週間を要します。パイロットまたは産業生産向けのスケーラブルなオプションも提供可能です。
  • Q:発現が難しい酵素にも対応できますか?

    A:はい。Creative Enzymesは、宿主選定、遺伝子工学的改変、分泌経路最適化、発酵戦略を組み合わせ、難発現タンパク質の生産を可能にします。
  • Q:技術文書一式は提供されますか?

    A:すべてのプロジェクトにおいて、コンストラクト設計、発現最適化、酵素収量、活性アッセイ、安定性、推奨スケールアップ手順を含む詳細レポートを提供します。

参考文献:

  1. Dong Z, Zhang J, Li H, Du G, Chen J, Lee B. Codon and propeptide optimizations to improve the food-grade expression of bile salt hydrolase in Lactococcus lactis. Protein Pept Lett. 2015;22(8):727-735. doi:10.2174/0929866522666150610094829
  2. Šnajder M, Carrillo Rincón AF, Magdevska V, et al. Extracellular production of the engineered thermostable protease pernisine from Aeropyrum pernix K1 in Streptomyces rimosus. Microb Cell Fact. 2019;18(1):196. doi:10.1186/s12934-019-1245-3

研究および産業用途にのみご使用ください。個人医療用途には適していません。一部の食品グレード製品は、食品および関連用途における処方開発に適しています。

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