UAGまたは四塩基コドンを用いたタンパク質発現

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部位特異的に非天然アミノ酸（uAA）を含むタンパク質を発現させる技術は、現代のタンパク質工学を大きく変革し、天然アミノ酸では実現できない新規化学反応性、安定性の向上、作用機序の制御、ならびに多様な機能付与を可能にしました。広く採用されている手法として、UAG（アンバー）サプレッションおよび設計型4塩基（クアドラプレット）コドンの利用は、タンパク質配列中の所定位置へ非標準残基を導入するための強力なアプローチです。

Creative Enzymesは、アンバーサプレッションまたはカスタム設計のクアドラプレットコドンによりuAAを組み込むタンパク質発現系に特化した高効率プラットフォームを提供します。精密に設計したtRNA/アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）ペア、最適化ホスト株、ならびに翻訳制御戦略を通じて、高収量、安定した導入忠実度、下流の分析または製造ワークフローへのシームレスな統合を実現するシステムを提供します。構造解析、機能増強、バイオオルソゴナル標識、クロスリンキング、あるいは合成生物学的経路の構築を目的とする場合でも、当社のカスタム発現ソリューションにより、天然遺伝暗号の限界を超えるタンパク質の創製が可能になります。

アンバーおよびクアドラプレットコドン技術の理解

アンバーサプレッションおよびクアドラプレットコドン技術は、生体のアミノ酸レパートリー拡張における最も影響力の大きいイノベーションの2つです。

アンバーサプレッション（UAGコドン）

アンバー終止コドン（UAG）は、以下の理由によりuAA導入のための極めて利便性の高い「導入口」となります。

天然での出現頻度が低いこと、
改変tRNA/aaRSペアにより高効率にサプレッション可能であること、そして
適切に制御すれば、ncAAをコードするよう再割り当てしても全体的なプロテオスタシスへの影響が最小限であること。

数十年にわたり、アンバーサプレッションは、E. coli、酵母、哺乳類細胞、ならびに無細胞系におけるuAA導入の基盤技術として用いられてきました。

Amber stop codons and their frequency in different species 図1. UAGコドン。（Shandell et al., 2021より改変）

クアドラプレットコドン

クアドラプレットコドン系は、生体内において完全に直交的なコードチャネル—すなわち当該生物において天然の意味を持たない追加の未使用「スロット」—を新たに創出することで、遺伝暗号をさらに拡張します。本戦略には以下の主要な利点があります。

天然の終止コドンとの競合を回避できること、
追加のncAAを完全に独立してコード化できること、そして
複数のプログラム可能な挿入部位を備えた真に拡張された遺伝暗号の設計を可能にすること。

クアドラプレット解読には、特殊なリボソーム工学および慎重に最適化されたtRNA構造が必要であり、高効率で信頼性高く実装できる研究グループは世界的にも限られます。

Scheme for the incorporation of quadruplet codons into proteins 図2. クアドラプレットコドンに応答した非標準アミノ酸の導入。（Chen et al., 2023）

課題と機会

UAGまたはクアドラプレットコドンを用いたタンパク質発現には、tRNA供給量、合成酵素の特異性、リボソーム効率、ncAAの輸送、ならびにコドンコンテキスト効果の精密なバランス調整が必要です。これらの要素が完全に同期した場合、フォトケージ基、ケトアナログ、蛍光団、酸化還元活性残基、求電子基、あるいは立体的に嵩高い構造など、要求度の高いncAAであっても高精度な導入が可能になります。

Creative Enzymesは、科学的厳密性、工学的深度、ならびに実用上の信頼性をもって、これらの発現系の設計・実装を専門としています。

提供内容

当社サービスは、アンバーサプレッションまたはクアドラプレットコドンのいずれかを用いてncAAを確実に組み込む発現系の構築および最適化に注力しています。各プロジェクトには、改変コンストラクト、調整済みホストプラットフォーム、ncAA特異的バリデーション、ならびに製造対応プロトコールを含む、一貫したエンドツーエンドのソリューションを提供します。

提供内容の主な特長

カスタム・アンバーサプレッションシステム

対象タンパク質、標的部位、選択された非天然アミノ酸に合わせて、高性能なUAGサプレッションシステムを設計・実装します。これには、最適化された直交tRNA/aaRS要素、コンテキストを考慮した発現コンストラクト、ならびに精密導入のための制御された誘導戦略が含まれます。

設計型クアドラプレットコドンシステム

追加のコード容量を要する用途に対して、完全にバリデートされたクアドラプレット解読モジュールを提供します。これには、特殊tRNA、必要に応じた改変リボソーム構成要素、ならびに最大効率とフレームシフト最小化に向けて調整された導入ワークフローが含まれます。

サービスワークフロー

Service workflow for the expression of proteins with UAG or quadruplet codons

サービス詳細

仕様	詳細
UAGサプレッションシステム	複数ホストに対応する高効率アンバーサプレッションモジュール直交性およびバックグラウンド低減のために最適化されたtRNA/aaRSペア嵩高い／反応性の高い種を含む、導入難易度の高いncAAに対応するよう設計されたサプレッションシステム
クアドラプレットコドン技術	拡張アンチコドンを有する改変tRNA 解読精度を高めるために必要に応じて用いるリボソーム変異体クアドラプレットコドンの柔軟な配置を可能にするモジュール式発現コンストラクト天然翻訳系からの直交性を達成するための戦略
対応ncAA	クリックケミストリー用のケト基／アジド基／アルキン基修飾残基フォトケージ化または光反応性アナログハロゲン化、金属結合性、または酸化還元活性残基蛍光または発色プローブ立体的に拡張された、または構造的にユニークな側鎖
発現プラットフォーム	サプレッション効率向上のために改変されたE. coli株バックグラウンド競合を低減した酵母システム安定な直交モジュールを有する哺乳類ホスト高感度用途または高収量用途に適した無細胞翻訳システム

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当社が選ばれる理由

翻訳工学における卓越した専門性

サプレッション技術に関する長年の経験により、各プロジェクトに深い科学的理解と実務的な精度を提供します。

優れた導入忠実度

誤導入、フレームシフト、バックグラウンドサプレッションを体系的に最小化し、意図したアミノ酸のみが挿入されることを担保します。

高収量の発現ソリューション

最適化ベクター、ホスト株、誘導戦略により、導入難易度が高い場合や複数ncAA導入の場合でも一貫したタンパク質収量を実現します。

多様なコドン解読オプション

従来型のアンバー系から完全直交のクアドラプレットコドンチャネルまで、実験プラットフォームへ円滑に統合できるツールを構成します。

包括的な分析サポート

質量分析から機能評価アッセイまで、発現タンパク質が構造的・化学的完全性に関する最高水準を満たすことを確認します。

協働型・プロジェクト志向の推進体制

全工程で密に連携し、目的に合わせて戦略を適応させ、最終システムが貴社ラボで直ちに使用可能となるようにします。

ケーススタディ

Case 1：タンパク質への非天然アミノ酸の部位特異的導入

哺乳類タンパク質への非天然アミノ酸の導入は、アンバー（UAG）終止コドンの再割り当てにより実現できます。3-ヨード-L-チロシンまたはp-ベンゾイル-L-フェニルアラニンに特異的な細菌由来アンバーサプレッサーtRNA/aaRSペアを用い、研究者らは標的遺伝子の所定位置にUAGを導入し、培養中に必要なアミノ酸を供給しました。改変tRNA/aaRS機構を発現する哺乳類細胞は、16～40時間以内に目的の非天然残基を含む全長タンパク質を産生しました。本手法は、標準的なクローニングおよび細胞培養法に依拠しつつ、構造研究およびタンパク質相互作用マッピングのための機能性化学ハンドルを部位特異的に導入でき、拡張タンパク質化学への堅牢なルートを提供します。

Site-specific incorporation of non-natural amino acids into proteins in mammalian cells with an expanded genetic code 図3. pBpaを導入するアンバーサプレッション効率の解析。（Hino et al., 2006）

Case 2：遺伝暗号拡張において、ニアコグネートサプレッションがtRNA^Pylと競合する

遺伝暗号の拡張は、終止コドンの再割り当てやクアドラプレットコドンの利用により、非標準アミノ酸（NCAA）をコード化することに依拠する場合が多くあります。しかし、ニアコグネートなアンチコドンを持つ天然アミノアシルtRNAがこれらの部位を誤読し、混合（「統計的」）タンパク質を生じる可能性があります。標準的なE. coli株におけるアンバー、オパール、ならびにクアドラプレットコドンを検討した結果、広く使用されているPylRS/tRNA^Pyl直交ペアであっても、天然アミノ酸の取り込みを完全には防げないことが示されました。本研究は、NCAA導入における重要課題であるバックグラウンドサプレッションを浮き彫りにし、真にクリーンな部位特異的NCAA導入を達成するための直交系改良の必要性を示しています。

Near‐cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl‐tRNAPyl for genetic code expansion 図4. クアドラプレットコドンAGGAはE. coliのin vivoでアルギニンをコードする。（A）BocK存在下／非存在下で培養し、pETtrio-pylT(UCCU)-sfGFP134AGGAで形質転換したBL21(DE3)細胞が産生したタンパク質。（B）BocK存在下（B）または非存在下（C）で培養した細胞が産生したsfGFPのESI-MS。（O'Donoghue et al., 2012）

よくあるご質問（FAQ）

Q：アンバーサプレッションの効率は天然翻訳と比べてどの程度ですか？

A：最適化された直交tRNA/aaRSシステムを用いることで、アンバーサプレッションは天然アミノ酸導入に近い効率に達し得ます。実際の性能は、宿主生物、ncAAの取り込み、mRNA上のUAGコドン位置、ならびに発現条件に依存します。十分にチューニングされたE. coli系では、80～90%を超える導入率が日常的に達成可能です。
Q：クアドラプレット系の実装は難しいですか？

A：クアドラプレット解読は、改変tRNAおよび多くの場合リボソーム変異体を要するため、技術的に高度です。しかし、当社のバリデート済み発現モジュールはプラグアンドプレイで使用できるよう設計されており、ユーザーには構成済みコンストラクトとホストを提供するため、複雑性は内部で吸収されます。
Q：複数種類の異なるncAAを組み込むタンパク質を発現できますか？

A：可能です。複数アンバーコドンの使用、UAGと異なるクアドラプレットコドンの組合せ、または追加の設計型コドン系の統合により、多残基導入を実現できます。多部位／多化学種導入を支えつつ忠実度を維持できるよう、各設計を最適化します。
Q：これらのシステムは製造スケールのワークフローに適合しますか？

A：はい。誘導戦略、ncAA供給、培養条件を適切に最適化することで、UAGサプレッションおよびクアドラプレットコドン系は、分析スケールから調製・製造スケールまでスケールアップ可能です。
Q：どのような種類の非天然アミノ酸を導入できますか？

A：当社プラットフォームは、蛍光プローブ、フォトケージ基、求電子性またはバイオオルソゴナルなハンドル、金属結合性リガンド、ならびに立体的に要求度の高いアナログなど、幅広いncAAに対応します。改変合成酵素によりチャージ可能で、宿主環境下で安定であれば、通常は対応可能です。
Q：ncAA導入の忠実度はどのように担保しますか？
A：以下を組み合わせて適用します。
- 最適化された直交合成酵素/tRNAペア、
- 制御された発現レベル、
- コドンコンテキスト解析、ならびに
- LC-MS/MSを含む厳格な下流QC。
これらにより、天然残基の誤導入を抑制し、目的のncAAが高精度で挿入されることを保証します。
Q：本技術は哺乳類細胞でも使用できますか？

A：もちろん可能です。発現宿主へのストレスを最小化しつつ高い忠実度を維持する、哺乳類細胞対応のサプレッションシステムを提供しています。これらのシステムは、HEK293、CHOなど一般的な細胞株において、治療候補、構造バリアント、または部位特異的修飾タンパク質の産生に適しています。
Q：標的タンパク質の発現が難しい場合はどうなりますか？

A：コドン配置、フォールディング補助、プロモーター強度、誘導タイミング、ncAA安定性など、発現ボトルネックを体系的に評価します。必要に応じて、コンストラクト再設計、シャペロン共発現、または培養条件の最適化により、堅牢な収量を達成します。
Q：収量の観点で、クアドラプレット系はアンバーサプレッションと比べてどうですか？

A：アンバーサプレッションは工学的成熟度が高いため、一般に高収量を得やすい傾向があります。クアドラプレット系はより複雑ですが、比類のないコード自由度を提供します。適切な最適化により、クアドラプレット解読の収量はアンバー系に近づけることが可能ですが、性能はタンパク質および宿主により変動します。

参考文献：

Chen Y, Gao T, He X, Niu W, Guo J. Genetic code expansion in mammalian cells through quadruplet codon decoding. In: Tsai YH, Elsässer SJ, eds. Genetically Incorporated Non-Canonical Amino Acids. Vol 2676. Springer US; 2023:181-190. doi:10.1007/978-1-0716-3251-2_13
Hino N, Hayashi A, Sakamoto K, Yokoyama S. Site-specific incorporation of non-natural amino acids into proteins in mammalian cells with an expanded genetic code. Nat Protoc. 2006;1(6):2957-2962. doi:10.1038/nprot.2006.424
O'Donoghue P, Prat L, Heinemann IU, et al. Near‐cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl‐tRNA^Pyl for genetic code expansion. FEBS Letters. 2012;586(21):3931-3937. doi:10.1016/j.febslet.2012.09.033
Shandell MA, Tan Z, Cornish VW. Genetic code expansion: a brief history and perspective. Biochemistry. 2021;60(46):3455-3469. doi:10.1021/acs.biochem.1c00286

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