サイト特異的変異導入のためのテンプレートDNA配列解析

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テンプレートDNAシーケンシング の重要な上流ステップです部位特異的変異導入による酵素工学 (SDM)親（テンプレート）DNAの正確な配列決定は、変異が検証済みでエラーのない遺伝的背景に導入されることを保証し、偽陽性結果や下流の発現失敗のリスクを排除します。 クリエイティブ酵素私たちは、変異導入前にテンプレートDNAの完全性、同一性、および準備状態を確認するために設計された高忠実度のシーケンシングおよび検証サービスを提供しています。このサービスは、正確な変異設計、信頼性のある構築生成、およびクローニングおよび発現段階へのスムーズな移行を保証します。

テンプレートDNAシーケンシング：SDMワークフローの基礎

標的指向変異導入法は、強力な分子ツールです。酵素工学アミノ酸残基の正確な修飾を可能にし、触媒活性、安定性、または基質特異性を向上させます。しかし、SDMの成功は基本的に出発DNAテンプレートの質に依存しています。わずかな配列の不一致や未検出の多型が、意図しない変異、酵素機能の低下、または実験の不一致を引き起こす可能性があります。

したがって、 テンプレートDNAシーケンシング 堅牢なSDMワークフローの基盤となります。変異導入の前に、全遺伝子配列とそのベクターコンテキストを検証することにより、研究者は実験の正確性と再現性を確保できます。Creative Enzymesは、高度なシーケンシング技術と厳格なバイオインフォマティクス検証を統合し、変異導入に使用されるすべてのテンプレートが最高の品質基準を満たしていることを確認します。

A simplified workflow of a site-directed mutagenesis strategy, starting with template DNA sequencing 図1. サイト指向変異導入戦略。最初のステップは、テンプレートDNAを準備することです。他者., 2003)

テンプレートDNAシーケンシングサービス

Creative Enzymesは、変異誘発に基づく酵素工学プロジェクトに特化した完全な配列決定および検証ソリューションを提供します。私たちのサービスには以下が含まれます：

包括的なテンプレートDNA検証全長遺伝子配列決定とベクターバックボーンの確認を含む。
エラーフリーのシーケンス検証 デュアルストランドと高カバレッジリードを使用して。
配列アライメントとアノテーション 参照または設計シーケンスに対して。
品質評価と報告書の作成クロマトグラム分析と信頼度スコアリングを含む。
オプショナルなプラスミド精製と品質管理 下流の突然変異誘発の前に。
カスタマイズされたシーケンシング戦略 （サンガーまたはNGS）テンプレートのサイズと複雑さに応じて。

サービスワークフロー

Service workflow of template DNA sequencing for site-directed mutagenesis

サービスの詳細

パラメータ	仕様
受け入れられるサンプルタイプ	プラスミドDNA、PCR産物、合成遺伝子
推奨濃度	≥100 ng/µL（プラスミド）；≥50 ng/µL（PCR産物）
純度要件	A260/A280比率は1.8〜2.0です。
ターンアラウンドタイム	通常3～5営業日です。
成果物	確認済みDNA配列とクロマトグラム品質評価の要約（カバレッジ、精度、ベースコールの信頼性）配列アライメントおよび変異準備証明書
オプションのアドオン	検証済み配列からの遺伝子合成発現ベクターへのサブクローニング将来の使用のための検証済みテンプレートの保管と文書化

私たちを際立たせるもの

高精度シーケンシング

デュアルプラットフォームシーケンシング（サンガー + NGS）は、塩基レベルの忠実性と信頼性を確保します。

専門的なバイオインフォマティクス

経験豊富な分子生物学者による詳細な配列検証と比較アライメント。

シームレスな統合

当社のサイト指向変異導入および発現サービスと完全に互換性があり、プロジェクトの継続性をスムーズにします。

カスタマイズされた戦略

プロジェクトのニーズに合わせた柔軟なプライマー設計、シーケンシングカバレッジ、および分析の深さ。

迅速な対応と信頼できる配送

効率的な物流とプロジェクト管理は待機時間を最小限に抑えます。

包括的なデータ報告

明確で出版準備が整ったシーケンシングレポート、完全なトレーサビリティと認証付き。

SDMのためのテンプレートDNAシーケンシング：ケーススタディ

ケース1：テンプレート検証による下流変異エラーの防止

クライアントのニーズ：

複数のポイント変異を加える準備をしている研究チームは、加水分解酵素遺伝子に対して一連の構造–機能研究を計画しました。サイト特異的変異導入（SDM）を開始する前に、実験の正確性を確保するためにプラスミドテンプレートの配列確認を依頼しました。

私たちのアプローチ：

重複プライマーセットを使用して全プラスミドSangerシーケンシングを実施し、コーディング領域および隣接する調節要素の完全なカバレッジを確保しました。我々の分析では、予期しない2つのサイレント多型と、より重要なことに、オープンリーディングフレーム内の単一塩基欠失が明らかになりました—これはリーディングフレームをシフトさせ、計画されたすべての変異を損なうエラーでした。相違点を報告した後、正しい遺伝子配列を再合成および再クローンし、クライアントにSDMの準備が整った完全に検証されたテンプレートを提供しました。

結果：

修正された構造を使用して、クライアントはすべての意図したミュータントを成功裏に生成し、それぞれが適切な折りたたみと期待される加水分解酵素活性を示しました。

ケース2：並行突然変異のための高スループットテンプレートスクリーニング

クライアントのニーズ：

熱安定性酸化還元酵素に取り組むバイオテクノロジーパートナーは、40種類の酵素バリアントのパネルにわたる並行変異導入を実施することを求めました。構築物が異なるクローニングバッチから派生したため、チームは高スループットの工学および発現試験を開始する前に、迅速かつ信頼性のある配列検証を必要としました。

私たちのアプローチ：

96ウェルプレートフォーマットを使用した高スループットシーケンシングワークフローを実装し、40種類のプラスミドを同時に処理できるようにしました。自動化されたテンプレート準備、効率的なプライマー設計、およびマルチプレックスサンガーシーケンシングにより、5日以内に完全なコーディング配列の検証が可能となりました。各配列は、点変異、フレームシフト、切断、意図しないクローニングアーティファクトについて分析されました。検証済みの構造体は、下流の突然変異誘発に備えた品質チェック済みのテンプレートライブラリにまとめられました。

結果：

検証されたテンプレートセットにより、クライアントは並行突然変異導入および発現スクリーニングを直接進めることができました。その後のアッセイでは、著しく熱安定性が向上した複数の酸化還元酵素バリアントが特定されました。

SDMのためのテンプレートDNAシーケンシング：よくある質問

Q: サイト特異的変異導入の前にテンプレートDNAシーケンシングが必要な理由は何ですか？

A: 配列決定は、親DNAが意図された野生型配列を正確に表すことを保証します。テンプレート内のエラーや多型は、変異導入の失敗や不正確なタンパク質発現を引き起こす可能性があります。
Q: どのようなシーケンシング方法を使用していますか？

A: 短から中程度の遺伝子にはサンガーシーケンシングを、複雑または長いテンプレートには次世代シーケンシング（NGS）を使用し、完全なカバレッジと精度を確保しています。
Q: どれくらいのDNAを提出すればよいですか？

A: 通常、高純度プラスミドDNAが10～20µg、またはPCR産物が200～500ngあれば、シーケンシングおよび品質管理に十分です。
Q: GCリッチまたは繰り返し領域をシーケンスできますか？

A: はい。私たちは、困難な領域を克服するために最適化された化学とプライマー設計戦略を使用し、信頼性の高いリードを確保しています。
Q: 私の確認済みのシーケンスを記録しておいてくれますか？

A: はい。クライアントの同意のもと、将来の突然変異誘発や発現プロジェクトを円滑に進めるために、検証済みの配列と文書を安全に保管しています。
このサービスはあなたの突然変異誘発ワークフローと組み合わせることができますか？

A: もちろんです。テンプレートシーケンシングは、サイト指向変異導入のための上流サービスと完全に統合されており、検証済みの構築物がすぐに変異導入と下流のアプリケーションに利用できるようになっています。

参照：

Allemandou F, Nussberger J, Brunner HR, Brakch N. プラスミドテンプレートを再現する2つのPCR生成DNA断片を使用した迅速なサイト特異的変異導入。 バイオメドリサーチインターナショナル2003;2003(3):202-207. doi:10.1155/S1110724303209141

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