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ランダム変異導入およびDNAシャッフルのためのエクスプレッションベクターへのクローン化

問い合わせ

成功した酵素工学を通じて ランダム変異誘発とDNAシャッフル 遺伝的多様性を生成するだけでなく、それらの変異体を機能スクリーニングのために効率的に発現させることにも依存しています。 クリエイティブ酵素私たちの エクスプレッションベクターへのクローン化 このサービスは、あなたの遺伝子構築物が適切なベクターシステム内で正しく挿入され、向きが整えられ、発現されることを保証します。これにより、効果的なミュータントライブラリの作成とその後の分析のための堅固な基盤が築かれます。

私たちは、ベクター選択や構築設計から検証および機能発現テストまで、エンドツーエンドのクローン作成サポートを提供します。野生型テンプレートの変異導入の準備やDNAシャッフリングのための組換え構築物の組み立てに関わらず、Creative Enzymesは最適化された発現システムへのシームレスな統合を保証します。

精密クローン技術、コドン最適化戦略、幅広いベクターシステムを活用することで、高効率のクローン作成、再現可能な発現、エラーのない構築検証を保証し、すべてのエンジニアリングバリアントが即座に実験に使用できる状態であることを確保します。

背景: ランダム変異導入のための遺伝子クローニング

ランダム変異導入とDNAシャッフル は、配列-機能空間を探求し、改善されたまたは新しい特性を持つ酵素バリアントを生成するための強力な技術です。しかし、最も洗練された突然変異誘発や組換え実験であっても、クローン化された構造が最適でない場合は失敗する可能性があります。

発現ベクターは、遺伝子の転写と翻訳のための機能的プラットフォームとして機能します。その設計—プロモーターの強度、リボソーム結合部位、タグ構成、ホストの互換性—は、変異体の発現とスクリーニングの成功を直接的に決定します。クローニングのエラー、フレームシフト、またはベクターの不適合は、誤った折りたたみのタンパク質、インクルージョンボディの形成、または発現の完全な喪失を引き起こす可能性があり、下流のスクリーニング効率に深刻な影響を与えます。

これらの落とし穴を避けるために、慎重に ベクトル選択、 精密な遺伝子挿入、そして 完全な確認 不可欠です。クリエイティブエンザイムズでは、高度な分子生物学の専門知識とハイスループットクローニング技術を組み合わせて、変異導入やシャッフルワークフローに最適化された検証済みの発現構造体を提供します。当社のサービスは、各遺伝子または組換え構造体が理想的なベクターシステムにクローニングされ、エラーを伴うPCR、組換え、発現、または活性スクリーニングの準備が整っていることを保証します。

Gene cloning service for random mutagenesis and DNA shuffling at Creative Enzymes

私たちが提供するもの

クリエイティブエンザイムズは、ランダム変異導入およびDNAシャッフルを利用した酵素工学プロジェクトに特化した包括的なクローン作成サービスを提供しています。私たちの専門知識は、ベクターデザイン、クローン作成の実行、構築物の検証を含み、すべての発現準備が整ったプラスミドが信頼性が高く再現可能であることを保証します。

カスタマイズされたベクター選択とデザイン

酵素の種類、ホストシステム、実験の目的に基づいて最適な発現ベクターの選択を支援します。選択肢には細菌（例： 大腸菌 pET、pBAD）、酵母（ピチア・パストリス、 サッカロマイセス・セレビシエ), 昆虫（バキュロウイルス）および哺乳類システム。ベクター要素—プロモーター、ターミネーター、タグ、選択マーカー—は、あなたの突然変異導入またはシャッフル戦略に合わせて調整されています。

精密遺伝子挿入および構築アセンブリ

制限酵素/リガーゼクローニング、ギブソンアセンブリ、またはゲートウェイクローニングなどの高忠実度クローニング技術を使用して、ターゲット遺伝子やシャッフルされた断片を方向性と読み枠を正確に制御して挿入します。複数の遺伝子構築物の場合、モジュラーアセンブリによりすべてのコンポーネントの機能的発現が保証されます。

合成またはクライアント提供の遺伝子のサブクローニング

あなたの遺伝子がCreative Enzymesによって合成される場合でも、外部から提供される場合でも、選択した発現ベクターへのサブクローニングを行い、配列の整合性と下流のライブラリ生成との互換性を維持します。

ランダム変異誘発テンプレートのクローン作成

ランダム変異誘発ワークフロー（エラープローンPCRや化学変異誘発を含む）に最適化されたベクター埋め込み構造を準備します。ベクターは、堅牢な増幅、高いコピー数、およびスクリーニングの容易さを考慮して選択されます。

DNAシャッフル構造のためのクローニング

DNAシャッフリングアプリケーションのために、断片交換、組換え接合部形成、および効率的なキメラ配列生成を促進する組換え構造体を組み立てます。相同な断片は、シャッフリング中の効率的なクロスオーバーを確保するために、互換性のあるベクターにクローン化されます。

検証と妥当性確認

すべての構築物は、挿入物の同一性、向き、および完全性を確認するために、完全な配列確認と制限酵素消化分析を受けます。詳細な報告書には、ベクターマップ、クロマトグラム、および注釈ファイルが含まれています。

サービスワークフロー

Workflow of vector cloning service for random mutagenesis and DNA shuffling

サービスの特徴

クローン技術と能力

  • 制限酵素/リガーションクローニング：従来型で堅牢、標準的なプラスミドシステムに最適。
  • ギブソンアセンブリとシームレスクローニング：多フラグメントアセンブリのための高効率で配列に依存しないクローニング。
  • ゲートウェイおよびゴールデンゲートシステム：ハイスループットアプリケーション向けのモジュラーおよび組み合わせクローン作成。
  • TAおよびTOPOクローニング：制限酵素なしでPCR増幅産物を迅速に挿入する方法。
  • DNAシャッフルのための再組換えベースのクローニング：高い忠実性でホモログまたはハイブリッドフラグメントの迅速な組み立てを可能にします。

サポートされているベクターシステム

  • 細菌: pET, pBAD, pUC, pQE, pCold、およびカスタム構築。
  • 酵母：pYES、pPICZ、pGAPZ、pRS、およびその他のための ピチア・パストリス または S. セレビシエ（S. cerevisiae）。
  • 昆虫：バキュロウイルスベクター（pFastBac、pVL1393など）。
  • 哺乳類: 一時的または安定した発現のためのpcDNA、pCMV、およびレンチウイルスバックボーン。
  • カスタムベクター：クライアント提供または独自のベクターへのクローン作成。

品質管理措置

  • 診断的制限酵素消化による検証。
  • 挿入部位およびフランキング領域の完全シーケンシング。
  • プラスミドの純度の評価（A260/A280 ≥ 1.8）および濃度。
  • クローン効率と再現性のための内部統制。

オプションの納品物

  • 表現の検証：推奨条件下での小規模な表現テスト。
  • 機能確認：クライアントの要望に応じたオプションの酵素活性アッセイ。
  • アーカイブと文書管理：長期的なプラスミド保存と再現性のための詳細なデジタル記録。

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私たちと提携する理由

包括的なベクトル専門知識

細菌、酵母、昆虫、哺乳類システムにおける豊富な経験が、各プロジェクトに最適なベクターとホストのペアリングを保証します。

変異導入およびシャッフルワークフローとのシームレスな統合

クローン構造は、当社の下流の多様化およびスクリーニングサービスと即座に互換性があります。

高精度クローン技術

私たちの高度な組み立て方法は、精度を保証し、不要な変異や向きの誤りを最小限に抑えます。

完全な検証と品質文書

各プラスミドは完全に検証され、完全なトレーサビリティのために詳細な報告書と共に提供されます。

迅速な対応と信頼できる結果

効率化されたワークフローにより、品質を損なうことなく、10～15営業日以内に完成した構造物を提供します。

専任の科学的サポートと機密保持

パーソナライズされたコンサルテーションとデータ保護により、あなたの研究が安全で科学的に確かなものとして保たれます。

代表的なケーススタディ

ケース1：リパーゼ遺伝子ライブラリをpET発現系にクローニングする

クライアントのニーズ：

バイオカタリシス会社は、エラー・プルーンPCRを使用して細菌リパーゼのランダムミュータントライブラリを生成する計画を立てました。しかし、既存の構造体には適切な発現タグが欠けており、溶解性のない発現が生じました。 大腸菌。

私たちのアプローチ：

N末端ヒスチジンタグと最適化されたリボソーム結合部位を含む修飾pETベクターを設計しました。リパーゼ遺伝子はギブソンアセンブリを使用してクローニングされ、配列決定によって方向性が確認されました。

結果：

新たにクローン化された構造体は、可溶性の発現と簡単な精製を可能にしました。その後の変異導入により、10,000以上のバリアントが生成され、その中のいくつかの変異体は2.5倍の高い活性と改善された熱安定性を示しました。確認されたベクターデザインは、今後のエンジニアリングプロジェクトのためのクライアントの標準テンプレートとなりました。

ケース2：酸化還元酵素のDNAシャッフルのための組換えクローニング

クライアントのニーズ：

異なる細菌種からのホモログ酸化還元酵素をシャッフルして補因子特異性を向上させることを目的とした研究コンソーシアムがありました。課題は、配列のミスアラインメントを導入することなく、ホモログ断片を単一の発現バックボーンに組み立てることでした。

私たちのアプローチ：

標準化されたフラグメント境界を使用して、再組換えベースのクローニングを行いました。各相同配列は中間ベクターにサブクローニングされ、確認された後、シームレスアセンブリシステムを使用して再組み換えされ、キメラ構造体が生成されました。

結果：

すべてのクローンハイブリッドはフルレングスシーケンシングによって確認され、正確なフラグメントの統合が示されました。得られた酵素は多様な補因子の好みを示し、1つの変異体はNADH特異性が3.8倍増加しました。このプロジェクトは、DNAシャッフルワークフローにおける精密クローン戦略の効果を検証しました。

ケース3：ランダム変異導入のためのエステラーゼ変異体の高スループットクローニング

クライアントのニーズ：

産業用酵素メーカーは、高スループット変異体スクリーニングのために、96種類のエステラーゼバリアントを発現ベクターに平行クローン化する必要がありました。手動クローン化は非効率的でエラーが発生しやすくなっていました。

私たちのアプローチ：

私たちは、Gateway互換ベクターを使用した自動クローン作成ワークフローを実装しました。各エステラーゼバリアントは、並行プロセスでベクターに挿入され、コロニーPCRおよびシーケンシングによって確認されました。

結果：

クライアントは2週間以内に、変異誘発の準備が整った完全に検証された発現ライブラリを受け取りました。このプロジェクトの成功により、会社のスクリーニングパイプラインが加速し、基質の回転率が向上し、溶媒耐性が強化された複数の改良型が得られました。

よくある質問

  • Q: どのようなタイプのベクターにクローンできますか？

    A: 私たちは、幅広い細菌、酵母、昆虫、哺乳類の発現ベクターをサポートしています。カスタムまたは独自のベクターもリクエストに応じて受け付けています。

  • Q: 一つのベクターに複数の遺伝子をクローンすることはできますか？

    A: はい。複数の遺伝子の共発現のために、モジュラーまたはポリシストロニッククローニングを行うことができ、経路工学や多ドメイン酵素の研究に最適です。

  • Q: クローン構造が正しいことをどのように確認しますか？

    A: すべてのクローン構造体は、正しい向きと配列の完全性を確認するために、診断的制限酵素消化、コロニーPCR、および接合領域の完全な配列確認を受けます。

  • Q: クローン後に発現テストを提供していますか？

    A: はい、選択したホストシステムでオプションの発現検証を行い、ランダム変異誘発やDNAシャッフルの前にタンパク質の生産を確認することができます。

  • Q: 提供されたプラスミドまたはベクターで作業できますか？

    A: もちろんです。クライアントが提供するベクターへのサブクローニングを行ったり、ワークフローとの互換性を最適化するためにそれらを修正したりすることができます。

  • クローン作成プロセスにはどのくらいの時間がかかりますか？

    A: 一般的な納期は、構造の複雑さと発現ホストに応じて10〜15営業日です。

  • Q: どのような情報を提供する必要がありますか？

    A: 対象遺伝子配列、希望するベクター（または発現系）、およびクローニングの制限や好みを提供してください。私たちのチームが設計と検証を行います。

  • Q: 機密保持と知的財産の保護を保証しますか？

    A: はい。すべてのプロジェクトデータ、プラスミド、シーケンスは厳格に機密保持され、クライアントは完全な知的財産権を保持します。

  • Q: 発現準備が整ったグリセロールストックを作成できますか？

    はい。直接変換または長期保存のために、確認済みクローンのグリセロールストックを提供できます。

  • Q: クローン構造体は、下流のランダム突然変異およびシャッフルサービスと互換性がありますか？

    A: はい。このサービスを通じて準備されたすべてのプラスミドは、私たちのランダム変異導入、DNAシャッフル、およびスクリーニングワークフローと完全に互換性があります。
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オンラインお問い合わせ

研究および産業用途にのみご使用ください。個人医療用途には適していません。一部の食品グレード製品は、食品および関連用途における処方開発に適しています。

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