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部位特異的変異導入変異体の発現と精製

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クリエイティブ酵素 提供する 部位特異的変異導入変異体の発現と精製 私たちのコアコンポーネントとして サイト指向変異導入（SDM）のためのダウンストリームサービスこのサービスは、遺伝子改変と機能的特性評価のギャップを埋め、各エンジニアリングされた酵素バリアントが正しく発現し、均一に精製されることを保証します。その後の生化学的および構造的分析のために、広範な異種発現系と精製技術を活用し、再現性があり、スケーラブルで高品質なタンパク質調製を提供します。活性評価、メカニズムの解明、または産業規模でのテストに焦点を当てている場合でも、Creative Enzymesは、すべての変異酵素に対して正確な実行、最適な収率、および構造的完全性を保証します。

エンジニアリングされた酵素の発現と精製のためのSDMの紹介

酵素の成功した工学によって サイト指向変異導入法 正確な遺伝子変化を導入するだけでなく、下流の特性評価のために正しく折りたたまれた機能的なタンパク質を得ることにも依存しています。しかし、変異酵素の発現は、溶解度、折りたたみ速度、または安定性の変化により困難になることがあります。微妙なアミノ酸の置換でさえ、発現レベルや精製プロファイルを乱し、誤って折りたたまれたまたは不活性な産物を引き起こす可能性があります。

クリエイティブエンザイムズは、これらの課題に対処します。 テイラード表現最適化 と 多段階精製ワークフロー 変異酵素の構造的および機能的完全性を維持するように設計されています。私たちの科学者は、タンパク質発現生物学における深い専門知識を、細菌、酵母、昆虫、哺乳類システムなど、さまざまな発現ホストに対応する高度な精製プラットフォームと組み合わせています。

Workflow of protein expression—target identification, cloning, transformation, and cell harvest—and protein purification steps including lysis, purification, and analysis図1. タンパク質の発現と精製のワークフロー。 (Ertem) 他者., 2022)

SDMバリアントの発現と精製：サービスと能力

表現から精製されたタンパク質までの統合された高品質のワークフローを提供することで、Creative Enzymesは研究者が変異設計から機能発見へとシームレスに移行できるようにし、すべてのバリアントが下流のアッセイで正確に表現されることを保証します。私たちの能力には以下が含まれます：

カスタマイズされた発現システムの選択

最適なホストの選択（例： 大腸菌、 バチルス、 ピチア・パストリスタンパク質の特性とプロジェクトの目標に基づいて、（細菌、昆虫、または哺乳類細胞）を選択します。

コドン最適化と発現ベクターの準備

宿主特異的コドン使用のための遺伝子配列の最適化と、適切な発現ベクターへのサブクローニング。

発現スクリーニングと最適化

誘導条件、温度、および発現レベルの評価により、可溶性収量を最大化し、包接体を最小化します。

包涵体の溶解と再折りたたみ

勾配折りたたみやシャペロン支援法を用いて、不溶性分画から活性タンパク質を回収するための専門的なプロトコル。

アフィニティおよびタグベースの精製

Ni-NTA、GST、His、FLAG、またはStrep-tag精製の使用、必要に応じてイオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせる。

エンドトキシン除去とバッファー交換

生化アッセイ、物理的特性評価、または細胞ベースの研究のための高純度タンパク質調製。

純度と誠実性の検証

SDS-PAGE、ウェスタンブロット、LC-MS解析によるタンパク質のサイズ、純度、および同定の確認。

柔軟な配信形式

ユーザー指定のバッファーと濃度で、凍結乾燥または溶液中で供給されるタンパク質。

サービスワークフロー

ステップ 詳細
プロジェクト相談とデザイン 私たちの科学チームは、あなたの構築、発現目標、および望ましい出力（例：可溶性酵素、膜タンパク質、タグ付き変異体）をレビューします。
宿主とベクターの選択 酵素のクラス、サイズ、および翻訳後のニーズに基づいて、最も適切な発現系とベクター構成を選択または推奨します。
表現のテストと最適化 小規模のパイロット実験が行われ、可溶性発現を最大化するための最適な誘導条件、宿主株、および温度が決定されます。
タンパク質の生産と収穫 最適化された条件下でスケールアップされた表現が行われ、その後、機械的または酵素的破壊方法を用いて細胞が破壊されます。
浄化 ターゲットタンパク質は、所望の純度と収率を達成するために、マルチステップクロマトグラフィー（アフィニティ、イオン交換、サイズ排除）を使用して精製されます。
品質確認 各バッチは、SDS-PAGE、純度定量、適用可能な場合の機能評価を含む徹底的な分析バリデーションを受けます。
配送と文書管理 最終的なタンパク質製品は、詳細なQCデータ、精製プロファイル、およびオプションの保存推奨と共に出荷されます。

サービスの接続

このサービスは、クリエイティブエンザイムズの統合された一部です。 サイト特異的変異導入のためのダウンストリームサービス遺伝子改変を機能的な洞察に変えるように設計されています。プロジェクトを拡張するために、次の点を考慮してください：

これらの3つのサービスは、発現と精製から活性の検証およびメカニズムの理解に至るまで、完全なダウンストリームワークフローを提供し、酵素工学の発見の完全なサイクルを可能にします。

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なぜ私たちを選ぶのか

包括的なシステムポートフォリオ

細菌、酵母、昆虫、哺乳類システムにおける幅広い経験が、多様な酵素変異体の成功した発現を保証します。

最適化されたワークフロー効率

統合された発現および精製プラットフォームは、ステップ間の移行時間を短縮し、プロジェクトの完了を加速します。

難しいタンパク質の専門的な取り扱い

不溶性変異体の再折りたたみと、凝集しやすい変異体の安定化における実績のある専門知識。

厳格な品質管理

各構造は、純度、同一性、活性を確保するために多層の検証を受けます。

スケーラビリティと柔軟性

能力は、スクリーニングのための小規模な分析バッチから、産業用途の大規模生産まで多岐にわたります。

下流分析とのシームレスな統合

精製されたタンパク質は、活性アッセイや構造研究に即座に使用できるアッセイ準備済みの形で提供されます。

代表的なケーススタディ

ケース1：低溶解度変異酵素の最適化された発現

クライアントのニーズ：

熱安定性キシラナーゼに取り組む研究所は、基質特異性を向上させるために設計された部位特異的変異体の可溶性発現を必要としていました。しかし、組換えタンパク質は、発現時に常に不溶性包接体を形成しました。 大腸菌機能アッセイや結晶化の試みを妨げています。

私たちのアプローチ：

私たちは複数の体系的評価を実施しました。 大腸菌 発現株（BL21(DE3)、Rosetta、およびArcticExpress）を用いて、IPTG濃度、温度、誘導後の時間を調整することで最適な誘導条件を最適化しました。可溶性が依然として最適でない場合、正しいジスルフィド形成を促進するために、酸化還元制御バッファー下での尿素勾配除去を用いた段階的な再折りたたみプロトコルを実施しました。分析用SECおよびSDS-PAGEにより、適切な再折りたたみと単分散性が確認されました。

結果：

可溶性収率は8倍に増加し、再折りたたまれたキシラナーゼは野生型の触媒活性の95%を保持しました。精製された変異体タンパク質は、X線結晶構造解析および動力学プロファイリングに成功裏に使用され、基質結合および熱適応メカニズムに関する構造的洞察を提供しました。

ケース2：メカニズム研究のための変異型酸化還元酵素のスケーラブルな精製

クライアントのニーズ：

産業バイオテクノロジー企業は、キネティックアッセイと結晶学のために50 mgのトリプルミュータント酸化還元酵素を生産することを目指しました。以前の 大腸菌 発現は低いタイターと異種の糖鎖修飾をもたらし、タンパク質の品質とバッチ間の再現性を損なった。

私たちのアプローチ：

私たちはプロジェクトを移行しました。 ピチア・パストリス 分泌タンパク質の生産に最適化された発現系。メタノール誘導率、培養密度、pHなどの発現パラメータは、収率を最大化するために微調整されました。下流の精製には、Ni-NTA親和性クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせた二段階プロセスが採用され、純度と構造的均一性が確保されました。各精製バッチは、配列の整合性を確認するためにSDS-PAGEおよびLC-MSによって検証されました。

結果：

このプロセスは、一貫してバッチごとに50 mg以上の酵素を生成し、純度は97%以上で、優れたバッチ間の再現性を示しました。トリプル変異体は野生型よりも7°C高い融解温度を示し、構造的安定性の向上を確認し、正確な動力学的および結晶学的分析を可能にしました。

よくある質問

  • Q: 発現および精製プロジェクトを開始するために提供すべき情報は何ですか？

    A: ターゲット遺伝子またはプラスミド配列、希望する発現ホスト、タグの好み、および既知の溶解性や安定性の問題を提供してください。

  • Q: 膜結合型または不溶性酵素で作業できますか？

    A: はい。私たちは、界面活性剤溶解、再折りたたみ戦略、および独自のバッファーシステムを使用して、膜タンパク質や不溶性酵素を定期的に発現させ、精製しています。

  • Q: どのような精製タグに対応できますか？

    A: 私たちは、His、GST、MBP、FLAG、Strep、およびカスタムフュージョンタッグをサポートしており、プロテアーゼ切断によるタッグ除去オプションも提供しています。

  • Q: 精製された変異体の活性をどのように確認しますか？

    A: 低温精製を通じて変性を最小限に抑え、SDS-PAGE、円偏光二色性、またはオプションの酵素アッセイを使用してタンパク質の折りたたみを確認します。

  • Q: 精製されたタンパク質は、構造解析や動力学に直接使用できますか？

    A: はい。私たちのタンパク質は、結晶化、クライオEM、または動力学研究に適したバッファーと濃度で提供されます。

  • Q: もし変異タンパク質の発現が悪い場合はどうなりますか？

    A: 我々は、低発現コンストラクトを救うために、代替ホスト、シャペロン共発現、コドン最適化など、複数の最適化オプションを提供しています。

参考文献：

  1. エルテム FB、ギュヴェン O、ビュユクダグ C、 他者SARS-CoV-2主プロテアーゼの生理的温度近くでの構造決定のためのプロトコル：連続フェムト秒結晶学による。 STARプロトコル2022;3(1):101158. doi:10.1016/j.xpro.2022.101158
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研究および産業用途にのみご使用ください。個人医療用途には適していません。一部の食品グレード製品は、食品および関連用途における処方開発に適しています。

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