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プロフェッショナルでコスト削減のソリューション

部位特異的変異導入バリアントの活性アッセイ

クリエイティブ酵素 提供する 部位特異的変異導入変異体の活性アッセイ専門的な ダウンストリームサービス 標的変異が酵素の性能に与える機能的影響を評価するために設計されています。高度な動力学測定、基質プロファイリング、およびハイスループットスクリーニング手法を組み合わせることで、エンジニアリングされた酵素の触媒効率、基質特異性、および調節特性に関する定量的な洞察を提供します。私たちのプラットフォームは、さまざまな酵素クラスと変異タイプに対応しており、研究者が遺伝子改変と機能的結果を正確に相関させることを可能にします。このサービスは、上流の突然変異誘発および発現ワークフローとシームレスに統合され、研究および産業用途の両方において信頼性が高く再現性のある解釈可能な活性データを確保します。

背景:部位特異的変異導入変異体の活性アッセイ

サイト指向変異導入法 構造–機能関係を理解し、酵素の特性を向上させるための強力なツールですが、変異はその機能的結果が定量化されて初めて意味を持ちます。たった一つのアミノ酸置換でも、動力学、基質結合、またはアロステリック調節を大きく変える可能性があります。慎重な活性の特性評価がなければ、酵素のメカニズムや工学的成果に関する貴重な情報が失われるかもしれません。

このニーズに応えるために、Creative Enzymesは高感度検出、宿主特異的発現分析、基質多様性研究を組み合わせた包括的な活性アッセイを提供しています。触媒効率の向上を確認すること、基質特異性を広げること、または温度およびpH耐性を評価することが目的であっても、私たちのプラットフォームは、さらなるエンジニアリングや商業開発を導くための堅牢で再現性のある詳細な酵素データを提供します。

Rate of reaction of wild-type enzyme and site-directed mutagenesis variants図1. サイト指向変異導入が酵素活性を向上させる。

私たちの提供するもの

当社のサイト特異的変異導入を用いたエンジニアリング酵素の包括的な活性アッセイサービスには、次のものが含まれます:

動的アッセイ

決定の kKM、Vマックスおよび、分光光度法、蛍光法、または色素法を用いて定義された条件下での触媒効率。

基質特異性プロファイリング

変異によって引き起こされる選択性の変化を特定するために、自然および合成基質のパネルに対する酵素活性の評価。

コファクターおよびエフェクター研究

コファクター、阻害剤、または活性化剤に対する酵素の反応の評価は、調節メカニズムを明らかにするためのものです。

熱およびpH安定性試験

温度およびpH勾配における残留活性の測定による、環境耐性に対する変異の影響の評価。

ハイスループットスクリーニング (HTS)

大規模な変異体ライブラリのための小型アッセイで、高性能なバリアントを効率的に特定します。

データ分析と解釈

野生型に対する変異体の性能の定量的および比較分析、包括的な報告を伴う。

精製タンパク質または粗リサイテの統合

精製タンパク質と全細胞ライセートの両方で実施されたアッセイは、柔軟性と迅速なスループットを提供します。

カスタマイズされたアッセイ開発

新しい酵素、複雑な基質、または産業的に関連する条件に合わせたアッセイの設計と実装。

サービスワークフロー

Service workflow of activity assays for site-directed mutagenesis variants

お問い合わせ

サービスの詳細

パラメータ 仕様
アッセイタイプ 分光光度法、蛍光法、発光法、色素法、または連結酵素アッセイ
酵素の供給源 精製タンパク質、細胞ライセート、または組換え発現系
基板範囲 自然および合成基板、産業用アナログを含む
測定範囲 ナノモル濃度の酵素濃度までの検出限界
運動パラメータ KM k、Vマックス触媒効率、阻害定数(Ki)
環境プロファイリング 温度(4~80°C)およびpH(3~10)の範囲における活性
オプションのアドオン ハイスループットスクリーニング、補因子/補酵素の最適化、阻害剤プロファイリング
成果物 生データと分析データ、グラフィカルな表現、詳細な活動報告書

広範な酵素活性測定サービスへの接続

サイト特異的変異体に特化したアッセイを超えて、Creative Enzymesはまた提供しています。 包括的な酵素活性測定サービス 幅広い酵素クラスと反応タイプを網羅しています。私たちの専門知識は、突然変異導入プロジェクトを超えて、標準化されたおよびカスタマイズされた活性アッセイを含んでいます。 酸化還元酵素転移酵素加水分解酵素リアーゼ異性化酵素、そして リガーゼ

これらのアッセイは、正確性、比較可能性、および多様な研究および産業用途における再現性を確保するために、厳密に制御された条件下で実施されます。変異体の正確な動的プロファイリングや野生型酵素のベンチマーク活性測定が必要な場合でも、当社の統合アッセイプラットフォームは、一貫した高品質の結果を提供します。

問い合わせ

なぜ私たちを選ぶのか

包括的な機能の洞察

変異がすべての関連する動的および調節パラメータに与える影響を特定する。

高感度と高精度

精密な検出プラットフォームを利用して微妙な活動の違いを捉えます。

柔軟なサンプル互換性

アッセイは、精製されたタンパク質、粗抽出物、または全細胞調製物に対して実施できます。

カスタマイズ可能なアッセイデザイン

特定の酵素クラスや特殊な基質に合わせたプロトコル。

迅速なデータ処理

最適化されたワークフローは、標準のプロジェクトタイムライン内で実行可能な結果を提供します。

下流分析とのシームレスな統合

結果は、構造研究、安定性最適化、または産業応用戦略を直接導くことができます。

ケーススタディと実践的な洞察

ケース1:触媒性能が向上したサイト指向フィターゼ変異体の活性特性評価

触媒効率と熱安定性を向上させるために アスペルギルス・ニガー N25フィターゼの3つの組換え変異株—PP-NPm-8、PP-NPep-6A、I44E/T252R-PhyA—は、エラー誘発PCRとサイト指向変異導入法を用いて構築されました。さらに、指向性進化とDNAシャッフルによる最適化により、T195L/Q368E/F376YやQ172R/K432Rなどの強化された変異体が得られました。後者は最高の熱安定性を示し、Q368E/K432Rは最も高い触媒活性を示しました。詳細な活性アッセイにより、特定された5つの置換(Q172R、T195L、Q368E、F376Y、K432R)が酵素の性能向上に相乗的に寄与していることが確認されました。これらの改変フィターゼ変異体は、特に高い触媒効率と熱耐性を必要とするプロセスにおいて、産業用途に強い可能性を示しています。

Improved thermostability and enzyme activity of a recombinant phyA mutant phytase from Aspergillus niger N25 by directed evolution and site-directed mutagenesis図2. PP-NP ep-6Aフィターゼおよびその変異体の熱安定性、pHおよび温度に対する活性のプロファイル。 (Tang) 他者., 2018)

ケース2:低温適応型WF146プロテアーゼ変異体の活性プロファイリング

指向進化と部位特異的変異導入を通じて、熱耐性サブチラーゼWF146プロテアーゼの低温性能を向上させるために、冷適応型変異体が設計されました。4つのアミノ酸置換を特徴とするRTN29変異体は、15〜25°Cでのカゼイン分解活性が6倍増加し、最適温度が15°C低下しましたが、60°Cでの熱処理後も部分的に熱安定性を保持しました。詳細な活性アッセイにより、安定性と触媒効率の間にトレードオフがあることが明らかになり、RTN29は基質結合領域付近の変異により基質特異性が変化しました。構造解析により、柔軟性の増加と基質親和性の変調が確認され、産業用途における冷活性触媒の酵素適応に関するメカニズムの洞察が提供されました。

Improvement of low‐temperature caseinolytic activity of a thermophilic subtilase by directed evolution and site‐directed mutagenesis図3. 258℃におけるWTおよび変異体のカゼイン分解活性の時間依存性。A: 50 mM Tris–HClバッファー(pH 8.0)中に1%カゼインと各酵素1.5 mg/mLを含む反応混合物に10 mM CaClを加えた。2 10 mM NaClを258℃でインキュベートしました。指定された時間に、TCA沈殿後の加水分解物上清の吸光度を280 nmで測定しました。B: 0.0625%(□)、0.5%(●)、または1%(Δ)カゼインの加水分解の時間経過。 他者., 2009)

よくある質問

  • Q: どのタイプの酵素でも測定できますか?

    はい。私たちは、特注の基質と検出方法を使用して、加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼなどをサポートしています。
  • Q: 精製タンパク質と粗抽出物の両方で作業していますか?

    A: はい。アッセイは、精製されたタンパク質または組換え細胞ライセートのいずれかに適応でき、柔軟性と迅速なスクリーニングを提供します。
  • Q: 大規模な変異ライブラリに対してハイスループットスクリーニングを実施できますか?

    A: もちろんです。大規模な変異ライブラリを効率的に評価するために、96ウェルおよび384ウェルフォーマット用のミニチュアプラットフォームを用意しています。
  • Q: どの運動学的パラメータが測定されますか?

    A: 私たちは測定します KMk、Vマックス触媒効率、阻害定数、および基質/補因子特異性。
  • Q: アッセイは非天然基質や工業用類似物を受け入れることができますか?

    はい。私たちは、自然の基質、合成基質、産業関連の基質のためのアッセイを設計し、検証します。
  • 結果はどのように報告されますか?

    A: クライアントは、公開または産業レビューに適した生データ、分析された表、運動プロット、および包括的な活動概要報告書を受け取ります。

参考文献:

  1. タン Z、ジン W、サン R、 他の人々改良された熱安定性と酵素活性を持つ組換えphyA変異体フィターゼ アスペルギルス・ニガー N25を指向性進化およびサイト特異的変異導入によって。 酵素および微生物技術2018;108:74-81. doi:10.1016/j.enzmictec.2017.09.010
  2. 中C、宋S、方N、 他者指向進化とサイト特異的変異導入による熱性サブチラーゼの低温カゼイン分解活性の改善。 バイオテクノロジーとバイオエンジニアリング2009年; 104(5): 862-870. doi:10.1002/bit.22473

研究および産業用途にのみご使用ください。個人医療用途には適していません。一部の食品グレード製品は、食品および関連用途における処方開発に適しています。

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