変異体ライブラリ評価のための活性アッセイ設計

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で クリエイティブ酵素私たちの 変異体ライブラリ評価のための活性アッセイ設計 サービスは、ミュータントライブラリの構築と機能発見のギャップを埋めます。私たちは、関連する条件下での酵素の性能を正確に反映する、精密で感度が高く、高スループットのアッセイシステムの開発を専門としています。触媒のターンオーバー、基質の変換、または生成物の形成を測定する際には、すべてのアッセイが堅牢で、スケーラブルで、再現可能であることを保証します。

私たちのチームは、生化学的な洞察を高度な検出技術と統合し、変異体ライブラリに最適化されたアッセイプラットフォームを提供します。これにより、優れた特性を持つ酵素バリアントを特定するための重要な分析フレームワークが提供されます。

背景：酵素工学のための合理的アッセイの開発

多様な酵素変異体ライブラリを構築した後の次の課題は、 酵素活性を効率的かつ信頼性高く評価するアッセイの設計は、変異体をどれだけ迅速にスクリーニングできるかだけでなく、機能的改善をどれだけ正確に検出できるかにも影響します。最適化が不十分なアッセイは、有望な変異体を隠したり、一貫性のないデータを生じさせたりする可能性があり、酵素進化プロジェクトを大幅に遅らせることになります。

これに対処するために、Creative Enzymesは特化したサービスを提供しています。 合理的なアッセイ開発アッセイ形式が生化学的に関連性があり、技術的に実現可能であり、高スループットプラットフォームと互換性があることを保証します。私たちは、酵素の触媒メカニズム、基質プロファイル、および望ましい特性（活性、選択性、安定性、または特異性）に合わせて、すべてのアッセイを調整し、突然変異から発見への効果的な架け橋を作ります。

Mutant selection by fluorescent-activated cell sorting 図1. 蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）および経路阻害剤スクリーニングを使用したランダム変異導入と高スループット変異体選択パイプライン。 (Trovão) 他者., 2022)

私たちの提供内容

私たちは、すべてのクラスの酵素に適した包括的なアッセイ設計および最適化サービスを提供しています。私たちの主な提供内容は次のとおりです：

アッセイコンセプトデザイン酵素の特性とターゲット反応に基づいた最適なアッセイ形式（分光光度法、蛍光法、比色法、クロマトグラフィー、または結合アッセイ）の選択。
基板と条件の最適化理想的な基質濃度、補因子レベル、バッファーシステム、および正確な活性測定のための温度/pH条件の特定。
検出方法の開発感度の高い定量検出システムの統合、UV/Vis吸収、蛍光、ルミネッセンス、またはHPLC/LC-MS分析を含む。
ハイスループットアッセイの適応96、384、または1536ウェルプレートフォーマットにおけるアッセイの小型化と自動化による効率的な変異体ライブラリスクリーニング。
検証とベンチマーキング信号対雑音比、直線性、再現性、およびダイナミックレンジの評価を行い、アッセイの信頼性を確保します。
カスタムアッセイキット社内スクリーニングを行うクライアント向けの、すぐに使用できるアッセイ試薬またはキットのオプション配送。
データ分析サポートデータ正規化、背景差分、パフォーマンス統計に関するガイダンスを提供し、厳密な解釈を確保します。

サービスワークフロー

Service workflow for designing activity assay methods for mutant library evaluation

サービスの特徴

パラメーター	説明
アッセイの種類	色彩測定、蛍光測定、発光測定、分光光度測定、クロマトグラフィー、または結合反応
スループット容量	10まで⁴–10⁵ サンプル/日（自動化システム）
楽器の互換性	マイクロプレートリーダー、分光光度計、蛍光計、LC–MS
カスタマイズレベル	評価中の酵素タイプと特性に完全に合わせて調整されています。
ターンアラウンドタイム	複雑さに応じて3～5週間
納品物	最適化されたアッセイプロトコル、バリデーションレポート、および（オプション）アッセイ試薬キット

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なぜ私たちを選ぶのか

メカニズムの専門知識

酵素メカニズムの深い理解は、生理学的および動力学的に関連するアッセイ設計を保証します。

包括的な検出オプション

複数の分析プラットフォームの習熟は、多様な酵素活性の正確な測定を可能にします。

高スループット準備状況

すべてのアッセイは、スケーラブルで自動化されたスクリーニングアプリケーション向けに設計されています。

定量的精度

再現性、直線性、感度が検証されたアッセイにより、信頼性の高いデータが保証されます。

シームレスな統合

開発されたアッセイは、私たちの変異体ライブラリおよびスクリーニングシステムと完全に互換性があります。

クライアント重視のカスタマイズ

酵素、ターゲット特性、およびスループット要件に合わせた柔軟なアッセイ形式。

代表的なケーススタディ

ケース1：エステラーゼライブラリスクリーニングのための比色アッセイの開発

クライアントのニーズ：

研究グループは、新しいエステル基質に対する触媒活性の向上を評価するために、大規模なエステラーゼ変異体ライブラリを迅速かつ高スループットで評価する方法を必要としていました。既存のHPLCベースのアッセイは、ライブラリ規模の分析には時間がかかりすぎました。

私たちのアプローチ：

エステル加水分解とクロモフォア放出を結合させた比色アッセイを開発し、410 nmでの吸光度を通じて生成物の形成をリアルタイムでモニタリングできるようにしました。反応条件は信号の直線性を最適化し、手法は384ウェルフォーマットに小型化されました。

結果：

このアッセイは、サンプルごとの分析時間を数時間から数分に短縮し、優れた再現性（CV < 5%）を示しました。クライアントは、5倍以上の活性を持ついくつかのエステラーゼ変異体を特定し、迅速な下流の動力学的特性評価への移行を可能にしました。

ケース2：脱水素酵素バリアント評価のための蛍光測定法

クライアントのニーズ：

製薬会社は、触媒効率を向上させるためにNADH依存性脱水素酵素の変異体を評価するための敏感な方法を必要としていました。目標は、何千もの変異体の間で微妙な活性の違いを検出することでした。

私たちのアプローチ：

NADH蛍光検出（励起/放出：340/460 nm）に基づいた蛍光測定法を設計しました。アッセイパラメータ（補因子濃度、pH、温度）を最適化し、信号対バックグラウンド比を向上させました。この方法は直線性の検証が行われ、96ウェルプレートに適応されて並行処理が可能となりました。

結果：

最終的なアッセイは高い感度を達成し、5%のような小さな活性の違いを検出しました。最適化されたプラットフォームにより、従来の分光光度測定アッセイと比較してスクリーニング時間を60%短縮し、トップパフォーマンスのバリアントを迅速に特定することができました。

ケース3：基質特異性の変化をプロファイリングするためのLC-MSベースの活性アッセイ

クライアントのニーズ：

サイトクロムP450変異体ライブラリを設計している製薬発見チームは、複数のプロドラッグ候補における基質特異性の変化を評価する必要がありました。多くの基質と生成物が重複するUV吸収プロファイルを持っていたため、従来の分光光度法アッセイではそれらを信頼性高く区別することができませんでした。クライアントは、高スループットスクリーニングに対応した選択的かつ定量的な方法を求めていました。

私たちのアプローチ：

私たちは、単一の実行で複数の基質–生成物ペアを検出できるLC-MSベースの活性アッセイを設計しました。イオン化効率と断片化パターンを調査した後、各化合物の最適化されたMRM遷移を確立しました。サンプル調製は96ウェルのワークフローに小型化され、分析的分離を犠牲にすることなく実行時間を短縮するためにクロマトグラフィー条件が改良されました。

結果：

この方法は、明確であいまいさのない製品検出と堅牢な活性定量を提供しました。クライアントは、1週間以内に全ライブラリをスクリーニングし、異なる基質嗜好のシフトを持ついくつかのP450バリアントを特定し、集中したフォローアップのエンジニアリングを可能にしました。

よくある質問

Q: どのような種類の酵素に対してアッセイを開発できますか？

A: 私たちは、酸化還元酵素、加水分解酵素、転移酵素、異性化酵素、リガーゼ、ライアーゼを含むすべての酵素クラスのアッセイを設計しています。
Q: 既存のアッセイを修正して性能を向上させることはできますか？

はい。既存のアッセイを最適化して、信号強度、再現性、またはハイスループット形式との互換性を改善することができます。
Q: 試薬や基質を提供していますか？

A: 使用可能なアッセイ試薬や基質を供給することができるか、最終プロトコルに詳細な調達情報を提供することができます。
Q: どのようにしてアッセイの再現性を確保しますか？

A: 各アッセイは、生物学的複製にわたる精度、信号の安定性、および線形応答を確保するために厳格な検証を受けます。
Q: アッセイは自動スクリーニングシステムと統合できますか？

A: はい。私たちのアッセイはロボット液体ハンドリングシステムおよび標準的なマイクロプレートリーダーと互換性があります。
データはどのように分析され、報告されますか？

A: 我々は、生データと処理済みデータを提供しており、背景補正、信号対雑音比の計算、パフォーマンス指標を含みます。
Q: 機密プロジェクトは保護されていますか？

A: 絶対に。すべてのプロジェクト情報と結果は厳密に機密であり、知的財産はクライアントに帰属します。

参照:

トロヴァン M、シュレーラー LM、マシャード A、他者産業生産に向けた微細藻類株の改良における有望な手法としてのランダム変異導入。 海洋薬剤2022;20(7):440。doi:10.3390/md20070440

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