トリプシン

トリプシン (EC 3.4.21.4) は、S1ファミリーおよびPAクランスーパーファミリーに属する膵臓のセリンプロテアーゼです。トリプシンは消化系に存在するプロテオリティック酵素で、タンパク質の消化に重要です。ヒトでは、トリプシンは最初に膵臓内で不活性型のトリプシノーゲンとして生成されます。その後、トリプシノーゲンは小腸に入り、活性型のトリプシンに変換されます。トリプシンの主な機能は、リジンまたはアルギニンのアミノ酸のカルボキシル側でペプチド鎖を切断することですが、いずれかがプロリンに続く場合は除きます。トリプシンの主な2つの形態は、α-トリプシンとβ-トリプシンです。

構造

ウシのトリプシノーゲンは、229個のアミノ酸からなる単一のポリペプチド鎖で構成され、6つのジスルフィドブリッジによって交差結合されています。トリプシンは223個のアミノ酸からなる単一のポリペプチド鎖で構成されています。トリプシンの活性部位には、His46とSer183が含まれています。トリプシンの天然型はβ-トリプシンと呼ばれ、α-トリプシンに自己加水分解され、ジスルフィドブリッジによって結合されています。β-トリプシンの自己加水分解は、ウシの配列におけるLys131およびSer132で切断されます。

図1. トリプシノーゲン（左）とトリプシン（右）の構造。(Elgendy, A. S. 2016)

トリプシンとキモトリプシンの構造は非常に似ていますが、2つの構造の間には1つの重要な違いがあります。キモトリプシンの特異性ポケットには189番目の位置にセリンが含まれているのに対し、トリプシンにはその位置にアスパラギン酸が含まれています。この構造の違いに基づいて、キモトリプシンは疎水性の芳香族アミノ酸を選択し、トリプシンは正の電荷を持つ塩基性アミノ酸を選択します。

メカニズム

トリプシンは、ペプチドをアミノ酸に分解する加水分解反応を触媒することができ、他のセリンプロテアーゼと一般的な触媒メカニズムを共有しています。トリプシンの活性部位は、セリン195、ヒスチジン57、およびアスパラギン酸102の3つのアミノ酸で構成され、これを触媒トライアドと呼びます。トリプシンの触媒プロセスのステップは以下の通りです。

• 基質結合。基質のアミノ酸側鎖残基は、トリプシンの活性部位に結合でき、この結合のカルボニル炭素は求核性セリン195の近くに位置します。
• 求核攻撃。ヒスチジン57は、求核体セリン195のヒドロキシル基がプロトンを抽出してカルボニル炭素を攻撃するのを助けます。求核攻撃により、Ser195側鎖と基質の間に共有結合が生成されます。水素結合は、2つのプロテアーゼのバックボーンアミドプロトンから形成されたペプチドカルボニル酸素上に発生する負の電荷を安定化させます。
• プロトン化。基質のアミド窒素はHis57から水素を供与され、基質のカルボキシル末端部分が自由ペプチドとして放出されます。
• エステル加水分解。最終ステップは、ペプチドとSer195酸素の間のエステル結合に対する水の攻撃です。通常のカルボキシル基を持つペプチドは2番目の生成物を生成し、セリンヒドロキシルを再生します。2番目のペプチドはその後、酵素から解離し、別の触媒サイクルを開始できるようになります。

図2. トリプシンの触媒メカニズム。

生理的機能

トリプシンは膵液に存在する重要な消化酵素です。膵臓は、タンパク質が十二指腸に到達すると、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、およびプロカルボキシペプチダーゼを放出します。トリプシノーゲンが膵管を介して小腸の粘膜細胞から分泌されるエンテロキナーゼに触れると、トリプシンが活性化されます。その後、トリプシンは、キモトリプシノーゲンやプロカルボキシペプチダーゼなどの他の消化酵素のジモゲンを活性化する役割を担い、これらはキモトリプシンやカルボキシペプチダーゼに変換されます。さらに、トリプシンはペプチドをより小さなアミノ酸の形に加水分解することができます。したがって、トリプシンは主にペプチド結合の加水分解の生物学的触媒として機能します。

応用

トリプシンは高純度で大量に入手可能であるため、さまざまな生物技術で広く使用されています。細胞培養中、トリプシンは細胞のパッセージおよび細胞の収穫プロセス中に接着細胞を再懸濁するために使用されます。トリプシンは、細胞固定および選別の前に解剖された細胞を分離するためにも使用できます。トリプシンは母乳中のカゼインを分解し、乳が半透明になる結果をもたらし、反応速度を測定するために使用できます。生物学的研究では、トリプシンは質量分析のためのプロテオミクス実験中にタンパク質をペプチドに消化するために一般的に使用されます。医療分野では、トリプシンは血栓を溶解し、炎症を治療するためにも使用されます。

参考文献