D-乳酸脱水素酵素（D-LDH）

関連する読書

序論

一部の呼吸鎖タンパク質は膜内在性サブユニット（例：フマル酸還元酵素、コハク酸脱水素酵素）を含む一方、D-乳酸脱水素酵素（D-LDH）のように膜周辺性タンパク質であるものも存在する。これらの呼吸酵素は、ギ酸、乳酸、コハク酸など多様な有機基質を酸化し、その後、酸素、硝酸、フマル酸などの各種酸化剤へ電子を移動させる。これらの反応で獲得される自由エネルギーは、溶質輸送やATP合成などを担う他の膜タンパク質によって利用され得る。E. coliは炭素源としてD-乳酸を利用し、電子伝達鎖へ2電子および2プロトンを供与する。電子受容体はキノンであり、反応はすべて内膜の細胞質側表面で進行する。

D-LDHの分離・精製には界面活性剤が必要であり、各種界面活性剤および脂質が酵素活性を増強し得ることが示されている。研究により、D-LDHは0.6 M塩酸グアニジンによりE. coli膜から溶出可能であり、アミノ酸組成は特に非極性に偏っていないことが示された。これは、D-LDHがE. coliにおける電子伝達に関与する他の一次脱水素酵素の一部と同様に、膜内在性タンパク質ではなく膜周辺性タンパク質であることを示唆する。D-LDHは571残基からなる65 kDaの単一ポリペプチド鎖で構成される。基質D-乳酸によるD-LDHの還元は二相性を示し、速い相は酵素‐基質複合体の迅速な形成を、遅い相は生成物ピルビン酸の酵素からの緩徐な解離を反映する。ニトロキシド・スピンラベルにより還元酵素が酸化される過程において、陰イオン性のD-LDHセミキノン（1電子還元体）が観察され、光学分光法および電子常磁性共鳴（EPR）分光法により同定されている。

D-LDHは近年見出されたFAD依存性タンパク質ファミリーに属し、FAD結合ドメインに保存残基を共有する。本ファミリーには、p-クレゾールメチルヒドロキシラーゼ（PCMH）、バニリルアルコールオキシダーゼ、UDP-N-アセチルエノールピルビルグルコサミン（MurB）などが含まれる。これらのタンパク質は真核生物および真正細菌の双方に存在し、多様な生物において多岐にわたる酸化還元反応を触媒する。D-LDHと同ファミリーの他タンパク質との最も顕著な構造差は膜結合ドメインにある。これらの構造差および他の膜周辺性タンパク質の構造との比較に基づき、研究者らはD-LDHの膜会合モデルを提唱している。

図1．膜に会合するD-LDHの模式図

FADファミリーの他メンバーとの比較

D-LDHの構造は、FAD結合ドメイン（残基1–268および520–571）、キャップドメイン（残基269–310、388–425および450–519）、膜結合ドメイン（残基311–387および426–449；このうち残基329–376は無秩序領域に位置する）という3つの独立したドメインから構成される。FAD結合ドメインは2つのα+βサブドメインからなる。キャップドメインは7本鎖の逆平行βシートで構成され、両側にαヘリックスを有する。膜結合ドメインは4本のαヘリックスから構成される。FAD結合ドメインとキャップドメインの接触界面には疎水性相互作用および極性相互作用が存在し、さらに表面両端には2つの塩橋（Arg-40–Asp-498およびArg-136–Glu-271）が形成されている。Leu-327とPhe-39の間の唯一の相互作用は、FAD結合ドメインと膜結合ドメインの界面に存在する。

BLASTプロファイル法および多重アラインメントプログラムを用いてD-LDH配列でデータベースをスクリーニングした結果、D-LDHは保存されたFAD結合ドメインを共有することを特徴とする、近年発見されたFAD依存性タンパク質ファミリーに属することが示された。D-LDHと同ファミリーのメンバー（MurB、PCMHなど）との配列同一性は全アラインメントで15%未満であるものの、N末端領域にはFAD結合ドメインの一部を含む保存残基が共有されている。これら保存残基の一部はFAD補因子の結合に関与し、別の一部は結合部位近傍に位置する。その結果、DALIプログラムが示すとおり、FAD結合ドメインの構造はこれらタンパク質間で相同であり、ロスマンフォールドとは区別される。明確な配列相同性は認められないものの、キャップドメインにおいても、程度は小さいながら同様の構造類似性が観察される。

図2．D-LDHの3つの各ドメインと、PCMHおよびMurBの対応ドメインとの比較