D-LDH

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はじめに

いくつかの呼吸タンパク質は、フマル酸還元酵素やコハク酸脱水素酵素のような膜内蔵サブユニットを含んでいますが、他のものはD-乳酸脱水素酵素（D-LDH）のような周辺膜タンパク質です。これらの呼吸酵素は、さまざまな有機基質（フォルミル酸、乳酸、コハク酸など）を酸化し、その後、さまざまな酸化剤（酸素、硝酸塩、フマル酸など）に電子を転送します。これらの反応から得られる自由エネルギーは、溶質輸送やATP合成などの他の膜タンパク質によって利用されることがあります。E. coliはD-乳酸を炭素源として使用し、電子伝達鎖に2つの電子と2つのプロトンを転送します。電子受容体はキノンであり、すべての反応は内膜の細胞質表面で行われます。

D-LDHの分離と精製には界面活性剤が必要であり、さまざまな界面活性剤や脂質が酵素活性を高めることができます。研究によると、D-LDHは0.6 Mの塩酸グアニジンでE. coli膜から溶出でき、そのアミノ酸組成は特に非極性ではないことが示されています。これは、D-LDHがE. coliの電子伝達に関与する他のいくつかの一次脱水素酵素と同様に周辺であることを示しており、膜内蔵タンパク質ではなく周辺タンパク質であることを示しています。D-LDHは571のアミノ酸残基から構成され、65 kDaの単一タンパク質鎖です。基質D-乳酸によるD-LDHの還元は2つの段階を示します。速い段階は酵素-基質複合体の迅速な形成を表し、遅い段階は酵素から生成物ピルビン酸の遅い放出を表します。陰イオンD-LDHセミキノン（1つの電子が還元される）が観察され、ニトロキシドスピンラベルによる還元酵素の酸化中に光学および電子スピン共鳴分光法を使用して同定されました。

D-LDHは最近発見されたFAD依存性タンパク質のファミリーに属し、これらはFAD結合ドメインに保存された残基を共有しています。このファミリーには、p-クレソールメチルヒドロキシラーゼ（PCMH）、バニリンアルコール酸化酵素、UDP-N-アセチルエノールピルビン酸グルコサミン（MurB）などのタンパク質が含まれています。これらのタンパク質は真核生物と真正細菌の両方に存在し、さまざまな生物でさまざまな酸化還元反応を触媒します。D-LDHとこのFADファミリーの他のタンパク質との最も重要な構造的違いは、膜結合ドメインにあります。これらの構造的違いに基づき、他の周辺膜タンパク質の構造との比較を通じて、科学者たちはD-LDHの膜との関連モデルを提案しました。

図1. 膜と関連するD-LDHのカートゥーン

FADファミリーの他のメンバーとの比較

D-LDHの構造は、FAD結合ドメイン（残基1-268および520-571）、キャップドメイン（残基269-310、388-425および450-519）、および膜結合ドメイン（残基311-387および426-449、残基329-376は無秩序領域に位置）という3つの離散なドメインで構成されています。FAD結合ドメインは、2つのα+βサブドメインで構成されています。キャップドメインは、各側にαヘリックスを持つ7本の逆平行βシートで構成されています。膜結合ドメインは4つのαヘリックスで構成されています。FAD結合ドメインとキャップドメインの接触インターフェースには疎水性および極性相互作用があり、表面の端には2つの塩橋（Arg-40-Asp-498およびArg-136-Glu-271）があります。Leu-327とPhe-39の間の唯一の相互作用は、FADと膜結合ドメインの間のインターフェースに存在します。

D-LDH配列を使用してBLASTプロファイル法および多重アラインメントプログラムでデータベースをスクリーニングした結果、D-LDHは最近発見されたFAD依存性タンパク質ファミリーに属し、保存されたFAD結合ドメインを共有することが特徴であることがわかりました。D-LDHとそのファミリーメンバー（MurB、PCMHなど）との間の配列同一性は、全体のアラインメントで15%未満ですが、N末端領域のいくつかの保存された残基を共有しており、いくつかはFAD結合ドメインに含まれています。これらの保存された残基の一部はFAD補因子の結合に関与しており、一部は結合部位の近くに位置しています。その結果、プログラムDALIによって示されるように、FAD結合ドメインの構造はこれらすべてのタンパク質で相同であり、ロスマン折り畳みとは区別されます。明らかな配列の類似性はありませんが、この構造的類似性はキャップドメインにおいてはやや観察されます。

図2. D-LDHの3つの個別ドメインとPCMHおよびMurBの対応するドメインの比較