酵素精製

さまざまな酵素精製サービスがCreative Enzymesで利用可能です。私たちは、臨床、治療、研究、化学産業向けに、天然資源や生産混合物から小規模な試験スケールまたは大規模な工業スケールでの精製と品質分析を提供しています。私たちのサービスは、精製後の回収と分析だけでなく、前処理のステップもカバーしています。

混合物やサンプルマトリックス内の酵素の初期特性評価は、活性測定や初期定量など実用的ですが、より基本的な知識は純粋な酵素サンプルでのみ行えるより高度な研究に依存しています。純粋な酵素は、干渉が少ないため、より簡単なアッセイを意味します。結晶学などのいくつかの分析方法は、サンプルの純度に敏感であり、最高のサンプル純度でのみ望ましい結果を得ることができます。工業用途の大規模生産において、酵素精製は製品の品質に直接関連しており、規制要件にも関係しています。したがって、酵素精製は研究と生産の両方の目的のために慎重に考慮され、操作される必要があります。しかし、この作業は簡単ではありません。多くの要因が精製中の効率、収率、活性の安定性を変える可能性があり、これらの要因の影響は酵素ごとに大きく異なります。Creative Enzymesでは、知識豊富な科学者と彼らの長年の経験に依存して、各酵素に最も適した精製プロセスを設計し実行しています。私たちは、顧客が異なるケースで純度、収率、安定性に対して異なる好みを持っていることを理解しており、これらのニーズを満たすために精製プロセスをさらにカスタマイズします。

ほとんどのサンプルは、実際の精製の前に準備する必要があります。細胞由来の酵素の場合、精製の前に成分に分画する必要があります。最初のステップは通常、細胞の均質化を含み、細胞壁を破壊して酵素を均質液に放出し、他の成分とともに放出します。細胞の種類によって、均質化は、硬い細胞壁のない哺乳類組織の場合のように簡単であるか、植物組織の硬い細胞壁のために摩擦、凍結、高圧などの厳しい条件が必要な場合があります。時には、より良い抽出のために追加の加水分解酵素や界面活性剤が加えられます。その後、混合物は遠心分離によって分画され、遠心管の底に重い物質の濃いペレットが得られ、上には軽い上清が得られます（図1）。上清は再度、より大きな力で遠心分離され、さらに別のペレットと上清が得られます。この手順は、差動遠心分離と呼ばれ、密度が減少するいくつかの分画を生成し、それぞれが数百の異なるタンパク質を含んでおり、次に精製される活性のためにアッセイされます。通常、1つの分画がそのような活性に富んでおり、より選択的な精製技術が適用される材料の供給源として機能します。温度、pH、緩衝塩、緩衝液の強度、イオン強度、浸透圧、添加物（EDTA、SDS、非イオン性界面活性剤など）、および均質化技術の選択は、精製の成功にとって重要です。

図1. 差動遠心分離。
参考文献: Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Biochemistry. 第5版. ニューヨーク: W H Freeman; 2002. セクション4.1

酵素の精製と分離は、一般的に溶解度、サイズ、極性、および結合親和性に基づいています。適切な分離方法を選択する際には、製造スケール、タイムライン、および酵素の特性をすべて考慮する必要があります。

• 溶解度に基づく分離

このタイプの分離の原理は、pH、イオン強度、または誘電率が変化すると酵素の溶解度が大きく変化することです。たとえば、ほとんどのタンパク質は高塩濃度で溶解度が低下し、これを塩析と呼びます。タンパク質が沈殿する塩濃度は、タンパク質によって異なります。したがって、塩析を使用してタンパク質を分画することができます。塩析は、他の精製ステップから得られた活性分画を含む希薄なタンパク質溶液を濃縮するのにも役立ちます。エタノールやアセトンなどの水に混和する有機溶媒を追加すると、溶媒の誘電率が変化し、目的の酵素が沈殿します。中性の水溶性ポリマーも有機溶媒の代わりに同じ目的で使用できます。ただし、沈殿中に酵素活性を失うリスクや、追加した塩やポリマーのさらなる分離を考慮する必要があります。

• サイズまたは質量に基づく方法

酵素は比較的大きな分子であるため、分子のサイズまたは質量に基づく分離は、特に高分子量の酵素の精製に有利です。透析は一般的に使用される方法で、半透膜を使用して塩、小さな有機分子、およびペプチドを除去します（図2）。このプロセスは通常、大量の透析液（透析バッグの外側の液体）と、平衡に達するまでの数時間または数日を必要とします。逆流透析カートリッジも使用でき、透析される溶液が一方向に流れ、透析液が膜の外側で反対方向に流れます。同様に、セルロースアセテートや他の多孔質材料で作られた超濾過膜を使用して、特定の分子量以上の酵素を精製および濃縮できます。分子量は分子量カットオフと呼ばれ、さまざまな膜からの広範囲で利用可能です。超濾過プロセスは通常、精製される酵素を充填したカートリッジで実施されます。遠心力または真空がプロセスを加速するために適用されます。透析と超濾過は迅速ですが、分子量の識別に関してはやや曖昧ですが、サイズ排除クロマトグラフィーは生の混合物から細かい分画を提供し、目的の酵素を小さな分子だけでなく、他の酵素やタンパク質からも分離することを可能にします。サイズ排除クロマトグラフィーは、ゲル濾過クロマトグラフィーとも呼ばれ、特定のサイズより小さい粒子をビーズに入れることを許可する定義された孔サイズを持つポリマービーズに依存しており、したがってカラムからの排出を遅らせます。一般的に、分子が小さいほど、カラムから出るのが遅くなります。サイズ排除樹脂は比較的「硬く」、高圧カラムで高い流量で使用できるため、分離時間が短縮されます。孔サイズ、タンパク質の形状、カラムの体積、エルエントのイオン強度などの他の要因も、精製の結果を変える可能性があります。

図2. 透析のスキーム。酵素分子（赤い点）は透析バッグに保持され、他の小さな分子（青い点）から分離されます。
参考文献: Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Biochemistry. 第5版. ニューヨーク: W H Freeman; 2002. セクション4.1

• 極性に基づく分離

他のタンパク質と同様に、酵素は極性、より具体的には、ネット電荷、電荷密度、および疎水性相互作用に基づいて分離できます。イオン交換クロマトグラフィーでは、負または正の電荷を持つ官能基を含むビーズのカラムを使用して酵素を分離します。陽イオン酵素は陰イオンカラムで分離でき、陰イオン酵素は陽イオンカラムで分離できます。

電気泳動は、電場を使用してイオンが固体または半固体のマトリックスまたは表面を透過し、電荷密度に基づいて成分を分離する手順です。SDS-PAGEマトリックスを使用した最も一般的な方法は、かなり標準化されており、ラボ間であまり違いはありません。SDS-PAGEでのタンパク質の移動距離は、その分子半径の対数に反比例し、これはおおよそ分子量に比例します。同様に、pH勾配のあるマトリックスを使用して等電点フォーカシング分離を行うことができます。タンパク質は電場の影響下で移動し、タンパク質のpIに達すると停止します（ネット電荷= 0）。使用されるマトリックスは、液体または円筒形または平らなプレートに注がれたゲルのいずれかです。

疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）は、疎水性相互作用を利用して異なる酵素を区別し、オクチルまたはフェニルセファロースなどのマトリックスに吸着させます。イオン強度が減少する勾配、または非極性溶媒濃度が増加する可能性がある条件を使用してタンパク質を溶出し、通常は比較的高純度の酵素を含む分画を得ることができます。高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）は、HICの分離の同じ原理を使用し、より細かく調整された材料で満たされているため、エルエントの選択肢が増え、より良い分離が得られます。HPLCは、極性、親和性、またはその両方に基づくことができることに注意してください。

• 親和性またはリガンドに基づく精製

親和性クロマトグラフィーは、酵素を精製するためのもう一つの強力で一般的に適用可能な手段です。この技術は、多くの酵素が特定の化学基に対して高い親和性を持つことを利用しています。一般的に、親和性クロマトグラフィーは、特定の基を認識するタンパク質を効果的に分離するために使用できます。(1) この基またはその誘導体をカラムに共有結合的に結合させ、(2) このカラムにタンパク質の混合物を追加し、結合していないタンパク質を除去するためにバッファーで洗浄し、(3) 親和性基の可溶性形態の高濃度を追加するか、結合親和性を低下させる条件を変更することによって目的のタンパク質を溶出します。親和性クロマトグラフィーは、酵素と餌として使用される分子の相互作用が非常に特異的である場合に最も効果的です。リガンド親和性クロマトグラフィーの特別な例は、Ni-NTA（ニッケル-ニトロロトリアセチル酸-アガロース）親和性クロマトグラフィーです。このリガンドは、ヒスチジンのみからなる6アミノ酸ペプチド（His6）に強く結合します。His6のcDNA配列は、特定の組換えタンパク質のcDNAに追加でき、His-TAGを含む組換えタンパク質が得られます。これにより、特別なリガンド親和性カラムを設計することなく、Ni-NTAを使用してそのようなタンパク質の親和性精製が可能になります。他の親和性クロマトグラフィーの形式には、染料リガンドクロマトグラフィー、免疫吸着クロマトグラフィー、および共有結合クロマトグラフィーが含まれます。

精製後、酵素は濃縮され、時には凍結乾燥されて、製品として分配される純粋で安定した形態を提供する必要があります。次の分析と品質認証は、酵素が望ましいものであり、合理的な濃度、安定性、および活性を持っていることを確認するために必要です。濃縮と認証には、酵素の品質を維持し、正しい特性評価方法を選択するために経験豊富な研究者が必要です。

Creative Enzymesは、さまざまな顧客の酵素精製のニーズを満たすために、長年にわたり酵素産業にサービスを提供してきました。私たちのサービスは、高純度、迅速なターンオーバー、専門的な技術サポートで際立っています。私たちのトップレートのサービスに関する質問や問い合わせについては、お気軽にお問い合わせください：

• 酵素精製
• タグ付けされた酵素のための親和性カラム（GST、Ni-NTA、タンパク質A/G/L樹脂など）
• 免疫沈降（IP）
• イオン交換（IEC）
• サイズ排除（SEC）およびゲル濾過（GF）
• 疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）
• 電気泳動
• 溶解度に基づく精製
• 包接体の溶解
• 酵素の回収と再折りたたみ
• エンドトキシン除去
• 品質管理
• 酵素特性評価
• 酵素品質認証