Rnase

リボヌクレアーゼ（一般にRNaseと略される）は、RNAをより小さな成分に分解する触媒であるヌクレアーゼの一種です。RNaseは一般的にエンドリボヌクレアーゼとエクソリボヌクレアーゼに分類され、EC 2.7（リン酸加水分解酵素）および3.1（加水分解酵素）タイプの酵素内にいくつかのサブクラスを含みます。RNaseの活性部位は裂谷のような形をしており、すべての活性側残基が谷の壁と底を構成しています。小さな基質は活性部位の中央にぴったりと収まることができ、残基との完璧な相互作用を可能にします。実際、この部位にはわずかな曲率があり、基質にも同様のことが起こります。それにもかかわらず、ほとんどのエクソリボヌクレアーゼとエンドリボヌクレアーゼは通常、配列特異的ではありません。動物の臓器はRNaseが豊富で、特に膵臓に多く含まれています。

分類

リボヌクレアーゼは主にエンドリボヌクレアーゼとエクソリボヌクレアーゼに分類されます。二本鎖DNAの非常に特異的な配列を切断する制限酵素に似て、特定の一本鎖RNAの配列を認識して切断するさまざまなエンドリボヌクレアーゼが最近分類されており、これにはRNase A、RNase H、RNase III、RNase L、RNase P、RNase PhyM、RNase T1、RNase T2、RNase U2、RNase Vが含まれます。RNase Aは、純化された結晶形で大量に得られる最初の酵素の一つであり、一般的な実験室での使用において主に頑丈です。ここでは、RNase A以外のすべての酵素が変性するまで粗い細胞抽出物を沸騰させることによって通常分離されます。RNase Aは一本鎖RNAに特異性を持ち、対になっていないCおよびU残基の3'末端を切断し、最終的にコファクターを必要とせずに2',3'-環状モノリン酸中間体を介して3'-リン酸化生成物を生成します。RNase Hも頻繁に使用されるエンドヌクレアーゼであり、加水分解メカニズムを介してRNAの切断を触媒し、5'-リン酸化生成物を残します。これは酵素結合の二価金属イオンによって助けられます。主要なエクソリボヌクレアーゼのタイプには、ポリヌクレオチドリン酸化酵素（PNPase）、RNase PH、RNase R、RNase D、RNase T、オリゴリボヌクレアーゼ、エクソリボヌクレアーゼI、エクソリボヌクレアーゼIIが含まれ、その中でPNPaseとRNase PHはヌクレオチジルトランスフェラーゼとしても機能します。RNase RはRNase IIの近縁であり、付随因子の助けなしに二次構造を持つRNAを分解することができます。

図1. RNase Aによって触媒される転移リン酸化および加水分解反応。(Cuchillo C M; et al. 2011)

機能

研究されたほぼすべての生物は、2種類の異なるRNaseを含んでおり、RNAの分解が非常に古く重要なプロセスであることを示しています。RNaseは、血管新生や開花植物における自己不和合性など、多くの生物学的プロセスにおいて重要な位置を占めています。原核生物の毒素-抗毒素システムにおける多くのストレス応答毒素は、RNase活性と相同性を示すことが確認されています。RNaseは、タンパク質を作るための遺伝物質を運ぶメッセンジャーRNAと、さまざまな細胞プロセスで機能する非コーディングRNAの成熟において重要な役割を果たします。RNaseは、もはや必要とされない細胞RNAを清掃することもできます。さらに、RNAウイルスに対する最初の防御としての活性RNA分解システムは、RNAiなどのより高度な細胞免疫戦略のための基盤となる機構を提供します。RNaseは非常に一般的であり、保護された環境にないRNAの寿命を非常に短くすることが通常です。なぜなら、いくつかの細胞はRNase AやRNase T1のような非特異的なRNaseを大量に分泌するからです。すべての細胞内RNAは、5'末端キャッピング、3'末端ポリアデニル化、RNAタンパク質複合体内での折りたたみなど、さまざまな戦略を通じてRNase活性から保護されています。別の保護方法は、いくつかの細胞型において細胞タンパク質の比較的大きな割合を含むRNase阻害剤の適用であり、特定のRNaseに対して最も高い親和性を持つタンパク質-タンパク質相互作用を持つことができます。RNase阻害剤-RNase A複合体の解離定数は、生理的条件下で約20 fMです。ほとんどの研究室は、環境中のRNaseからサンプルを保護するためにRNase阻害剤を利用しています。

RNase汚染

分子生物学実験におけるRNAの抽出は、RNAサンプルを分解する可能性のある遍在し頑丈なRNaseの存在により、非常に複雑です。特定のRNaseは非常に頑丈であり、その不活化はDNaseを中和することと比較して非常に困難です。細胞から放出されたRNaseの他に、環境中にもいくつかのRNaseが存在します。RNaseはさまざまな生物において多くの細胞外機能を示すように進化しています。たとえば、人間の皮膚から分泌されるRNase 7は、RNase Aスーパーファミリーの一員であり、強力な抗病原体に対する防御として機能することができます。これらの分泌されたRNaseの酵素的RNase活性は、その新しい拡張機能にとって必ずしも必要ではないかもしれません。

RNaseの不活化

RNaseは非常に安定しており、いくつかの極端な条件下で一時的に不活化されることがありますが、制限因子を除去した後に迅速に再活性化されることができます。従来の高温高圧蒸気滅菌やタンパク質阻害剤では、RNaseの活性を完全に無効化することはできません。RNaseは人間の皮膚に広く分布しているため、RNAの準備に関連する分子生物学実験では手袋を使用する必要があります。通常、液体ディスペンサーの内外表面は、DEPCで調製された70%エタノールで擦られ、基本的に要件を満たします。ガラス器具は通常、140度のオーブンで3時間焼かれます。

参考文献