RNase（リボヌクレアーゼ）

リボヌクレアーゼ（Ribonuclease：一般にRNaseと略記）は、RNAをより小さな構成要素へ分解する反応を触媒するヌクレアーゼの一種である。RNaseは概ねエンドリボヌクレアーゼとエキソリボヌクレアーゼに分類され、酵素分類（EC）では、リン酸分解（ホスホロリシス）型酵素に相当するEC 2.7および加水分解（ハイドロリシス）型酵素に相当するEC 3.1の範疇に含まれる複数のサブクラスを包含する。RNaseの活性部位は裂谷（リフトバレー）のような形状を呈し、活性部位残基が谷の壁面および底面を形成している。小さな基質は活性部位中央に適合し、残基との最適な相互作用が可能となる。実際には活性部位にはわずかな湾曲があり、基質側にも同様の湾曲が見られる。しかしながら、多くのエキソリボヌクレアーゼおよびエンドリボヌクレアーゼは通常、配列特異性を示さない。動物の臓器にはRNaseが豊富に存在し、特に膵臓に多い。

分類

リボヌクレアーゼは主としてエンドリボヌクレアーゼとエキソリボヌクレアーゼに大別される。二本鎖DNAの高度に特異的な配列を切断する制限酵素と同様に、一本鎖RNAの特定配列を認識して切断する多様なエンドリボヌクレアーゼが近年分類されており、RNase A、RNase H、RNase III、RNase L、RNase P、RNase PhyM、RNase T1、RNase T2、RNase U2、RNase Vなどが含まれる。RNase Aは、精製結晶として大量に得られた最初期の酵素の一つであり、一般的な実験室用途において特に堅牢である。本酵素は、粗細胞抽出液を煮沸し、RNase A以外の酵素を変性させることで通常単離される。RNase Aは一本鎖RNAに特異性を示し、非対合のCおよびU残基の3'側を切断し、補因子を必要とせず、2',3'-環状モノリン酸中間体を経て最終的に3'リン酸化産物を生成する。RNase Hも頻用されるエンドヌクレアーゼであり、加水分解機構によりRNAを切断して5'リン酸化産物を残す。この反応は酵素結合型の二価金属イオンにより補助される。主要なエキソリボヌクレアーゼには、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）、RNase PH、RNase R、RNase D、RNase T、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼI、エキソリボヌクレアーゼIIなどがあり、このうちPNPaseおよびRNase PHはヌクレオチジルトランスフェラーゼとしても機能する。RNase RはRNase IIの近縁ホモログであり、補助因子の助けなしに二次構造を有するRNAを分解できる。

図1．RNase Aが触媒する転リン酸化反応および加水分解反応。（Cuchillo C M；et al．2011）

機能

研究対象となったほぼすべての生物には2種類の異なるRNaseが存在しており、RNA分解が非常に古くから存在する重要なプロセスであることを示唆している。RNaseは、血管新生や被子植物における自家不和合性など、多くの生物学的プロセスにおいて重要な位置を占める。原核生物の毒素—抗毒素（toxin-antitoxin）システムにおける多くのストレス応答性毒素は、RNase活性および相同性を示すことが実証されている。RNaseは、タンパク質合成の遺伝情報を担うメッセンジャーRNA（mRNA）および多様な細胞内プロセスで機能する非コードRNAの双方の成熟において中核的役割を果たす。またRNaseは、不要となった細胞内RNAの除去にも寄与する。さらに、RNAウイルスに対する第一線の防御としての能動的RNA分解システムは、RNAiなどのより高度な細胞性免疫戦略の基盤となる機構を提供する。RNaseは極めて普遍的であり、RNase AやRNase T1のような非特異的RNaseを大量に分泌する細胞も存在するため、保護環境下にないRNAは通常きわめて短い半減期となる。注目すべき点として、細胞内RNAは、5'末端キャッピング、3'末端ポリアデニル化、ならびにRNA-タンパク質複合体内での折りたたみなど、複数の戦略によりRNase活性から保護されている。別の保護法として、一部の細胞種では細胞タンパク質の比較的大きな割合を占めるRNase阻害因子（RNase inhibitor）が存在し、特定のRNaseに対してタンパク質—タンパク質相互作用として最高レベルの親和性で結合し得る。生理条件下におけるRNase阻害因子—RNase A複合体の解離定数は約20 fMである。多くの研究室では、環境由来RNaseによる分解から試料を保護するためにRNase阻害因子を利用している。

RNase汚染

分子生物学実験におけるRNA抽出は、遍在性が高く堅牢なRNaseがRNA試料を分解し得るため、極めて困難である。特定のRNaseは非常に安定であり、DNaseの失活化と比較して不活化が著しく困難である。細胞から放出されるRNaseに加え、環境中にも複数のRNaseが存在する。RNaseは多様な生物において細胞外機能を発揮するよう進化してきた。例えば、ヒト皮膚から分泌されるRNase 7はRNase Aスーパーファミリーの一員であり、強力な抗病原体防御として機能し得る。これら分泌型RNaseの酵素学的RNase活性は、新たに拡張された機能に必ずしも必要ではない可能性がある。

RNaseの不活化

RNaseは非常に安定であり、極端な条件下では一時的に失活させることができるものの、制限因子を除去すると速やかに再活性化し得る。従来の高温・高圧蒸気滅菌やタンパク質阻害剤によっても、RNase活性を完全に失活させることはできない。RNaseはヒト皮膚に広く分布しているため、RNA調製に関連する分子生物学実験では手袋の着用が必須である。通常、液体ディスペンサーの内外面はDEPCで調製した70%エタノールで清拭し、基本的な要件を満たすようにする。ガラス器具は通常、140℃のオーブンで3時間ベーキングする。

参考文献