硝酸還元酵素

硝酸還元酵素（NR、EC 1.6.6.1-3）は、硝酸同化の初発酵素であり、NAD(P)H から人工受容体および酸化還元タンパク質へ電子を供与する反応を媒介し得る多ドメインタンパク質である。NR による硝酸（NO3−）から亜硝酸（NO2−）への酵素的還元は、多くの作物植物における窒素獲得に不可欠である。これは、主基質である硝酸がシグナル伝達に必要であり、施肥土壌における主要な窒素源として機能するためである。NR は、複数の制御機構を介して還元型窒素のフラックスを統御し、植物・藻類・菌類における代謝統合の中枢を担う。NR は、補欠分子族であるモリブドプテリン、Fe-ヘム、および FAD（フラビンアデニンジヌクレオチド）を 1:1:1 の化学量論比で含み、FAD ドメインおよび Mo-プテリン（Mo-pterin）ドメインがそれぞれ NAD(P)H および NO3− の結合部位となる。シトクロム b5 様ヘムドメインは、FAD ドメインから活性部位の Mo-プテリンへの電子移動を促進する。

構造

NR のモノマーは、約 100 kD のポリペプチド、ヘム鉄、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）、およびモリブデン-モリブドプテリン（Mo-MPT）から構成される。NR の 8 つの配列セグメントは、それぞれ N 末端「酸性」領域、硝酸還元活性部位を有する Mo-MPT ドメイン、インターフェースドメイン、14-3-3 結合タンパク質による阻害を伴う可逆的活性制御においてリン酸化されるセリンを含むヒンジ 1、シトクロム b ドメイン、ヒンジ 2、FAD ドメイン、NAD(P)H ドメインである。三次元の二量体 NR 構造モデルは、亜硫酸オキシダーゼおよびシトクロム b 還元酵素の構造に基づいて構築されている。

図 1. 硝酸還元酵素の構造。（Campbell W H. 1996）

特筆すべき点として、膜貫通型の呼吸性 NR は 3 つのサブユニット（α、β、および 2 つの γ）から構成される。これは Escherichia coli において嫌気性 NR を代替する第 2 の硝酸還元酵素として機能し、嫌気呼吸時にプロトンポンプとして作用するとともに、硝酸を電子受容体として利用可能にする。NR の γ サブユニットはシトクロム b に類似し、キノンから β サブユニットへ電子を移送する。高等植物の NR は細胞質タンパク質に分類されるが、形質膜外側に存在する GPI アンカー型バリアントも報告されている。

分類

真核生物の NR は、モリブデン酵素の亜硫酸オキシダーゼファミリーに属し、NADH または NADPH から硝酸へ電子を移送することができる。

原核生物の NR は、モリブデン酵素の DMSO 還元酵素ファミリーの一員である。これらは、同化型硝酸還元酵素（Nas）、呼吸性硝酸還元酵素（Nar）、およびペリプラズム型硝酸還元酵素（Nap）の 3 群に区分されており、活性部位は Mo イオンで、2 分子のプテリンに由来する 4 つのチオラート機能に関与する。Mo は、1 つのアミノ酸側鎖および酸素および／または硫黄配位子により配位され、Nap ではシステイン配位子により、Nar ではアスパラギン酸により、タンパク質へ共有結合的に結合している。これら酵素の一部における Mo イオンの正確な配位環境については、なお議論がある。

機構

硝酸分子は、+6 の酸化状態にある Mo イオンを有する活性部位に結合する。活性部位への電子移動は、プロトン-電子移動段階においてのみ完結し、この段階では MoV 種が触媒作用において重要である。モリブデン配位圏に存在する硫黄原子は、溶媒からの攻撃を防護する擬似ジチオレン配位子を形成し得る。硝酸結合に伴い、この環のコンフォメーション再編成が生じ、保存性の高いメチオニン Met141 および Met308 により安定化される。この再編成により、硝酸が MoVI イオンと直接相互作用できるようになる。機構の第 2 段階では、硝酸が亜硝酸へ還元され、この過程にはモリブデンではなく硫黄原子の酸化が関与する。2 つのジメチル-ジチオレン配位子は、Mo 原子近傍に生じる過剰な負電荷を分散させ、化学反応を進行可能にするうえで重要である。本機構は、Mo イオンのみに基づくと広く受け入れられてきた酸化還元化学ではなく、モリブデンおよび硫黄に基づく酸化還元化学を示唆する。機構の後半には、MoV 種の存在により促進される 2 段階のプロトン化が含まれる。プロトンおよび電子の利用可能性に応じて、この段階では MoVI 中間体も存在し得る。水分子が生成した後は、MoVI 種のみが、水分子の解離とそれに伴う酵素回転を進行させ得る。

図 2. 呼吸性硝酸還元酵素による硝酸還元の提案機構。（Coelho C; et al. 2015）

応用

硝酸還元酵素による硝酸から亜硝酸への還元、および亜硝酸還元酵素による亜硝酸からアンモニウムへの還元は、無機硝酸をアンモニウムへ生物学的に変換する主要な 2 つの過程であり、全体として 8 電子還元過程である。NR は、一酸化窒素（NO）の重要な酵素的供給源である可能性が提唱されている。さらに NR は、ジアホラーゼ／脱水素酵素ドメインを介して NAD(P)H から電子を移送し、ジオキシゲナーゼ活性により NO を捕捉するトランケートヘモグロビン THB1、ならびに亜硝酸からの NO 合成を担うモリブデン酵素である NO 生成型亜硝酸還元酵素（NOFNiR）へ電子を供与することで、NO の恒常性維持にも関与する。光合成生物における重要なシグナル分子 NO の恒常性は、2 つの主要なモリブデン酵素（NR および NOFNiR）ならびにヘモグロビンのジオキシゲナーゼ能に依存している。

NR 活性は、降雨収量および穀粒タンパク質生産を予測するための生化学的ツールとして利用できる。NR はまた、茶葉におけるアミノ酸生成を増強する。南インドの条件下では、Mo とともに各種微量栄養素を散布した茶樹において、茶芽のアミノ酸含量の増加および収量の増大が報告されている。

参考文献