MNase

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概要

マイクロコッカルヌクレアーゼ（MNase）は、ヌクレオソーム接合部領域のDNAのみを分解するヌクレアーゼであり、ヌクレオソーム上のDNAはヒストン1により保護されているため分解されません。マイクロコッカルヌクレアーゼは Staphylococcus aureus 由来で、比較的非特異的なエンド／エキソヌクレアーゼです。本酵素は組換え E. coli 株から精製され、二本鎖、一本鎖、環状および直鎖の核酸を消化します。酵素活性はpH 7.0～10.0の範囲で認められ、RNAおよびDNA基質のいずれに対してもpH 9.2で最適活性を示します。アデニル酸、デオキシアデニル酸、またはチミジル酸に富む部位で切断の嗜好性が観察されています。DNAおよびRNAはいずれも、3'リン酸モノヌクレオチドおよびジヌクレオチドへ分解されます。

由来

本酵素は Staphylococcus aureus の細胞外ヌクレアーゼです。一般的な供給源として、S. aureus の細胞外ヌクレアーゼ（マイクロコッカルヌクレアーゼ）をコードするクローニング済み遺伝子を保持する E. coli 細胞が用いられます。

構造

マイクロコッカルヌクレアーゼ（当時はスタフィロコッカルヌクレアーゼとして知られていた）の三次元構造は、タンパク質結晶学の黎明期に解明されました。現在では、Protein Data Bankの1SNO（アポ型）や、チミジン二リン酸により抑制された型として3H6Mおよび1SNCなど、より高分解能の新しい結晶構造が利用可能です。ヌクレアーゼ分子は、3本の長いαヘリックスと、5本連結の樽状βラメラから構成され、OBフォールド（オリゴヌクレオチド結合フォールド）として知られる配置をとります。

マイクロコッカルヌクレアーゼの手順

• 目的遺伝子の取得

1. PCR法：目的遺伝子を含むクローニング済みプラスミドを鋳型として、遺伝子配列に基づきプライマー対を設計します（上流および下流プライマーに異なる制限酵素部位を導入）。PCRサイクルを実施し、目的の遺伝子断片を取得します。
2. RT-PCR法：TRIzol法により細胞または組織から全RNAを抽出し、mRNAを鋳型として逆転写によりcDNA第一鎖を合成します。逆転写産物を鋳型としてPCRサイクルを行い、産物を得ます。

• 組換え発現ベクターの構築

1. マイクロコッカルヌクレアーゼベクターの消化：発現プラスミドを制限エンドヌクレアーゼ（プライマーで導入した同一部位）で二重消化し、消化産物をアガロース電気泳動で分離後、ゲル回収キットまたは凍結融解法によりベクター断片を回収します。
2. PCR産物を二重消化後に回収し、T4 DNAリガーゼによりベクターへライゲーションします。

• 組換え発現プラスミドを含む発現株の取得

1. ライゲーション産物を E. coli DH5αに形質転換し、マーカー（Amp耐性または青白選択）に基づいて組換えベクターをスクリーニングします。単一コロニーを選択し、アルカリ溶解法により少量のプラスミドを抽出し、二重消化により予備同定します。
2. シーケンス解析により、目的遺伝子の挿入方向およびリーディングフレームが正しいことを確認したうえで次工程へ進みます。正しくない場合は、追加クローンをスクリーニングし、サブクローニングを繰り返す、または別の制限酵素部位でサブクローニングを行います。
3. 当該組換えプラスミドDNAを用いて、宿主菌の受容細胞へ形質転換します。

• 発現誘導

用途

• 無細胞粗抽出液中の核酸の加水分解。
• RNAシーケンシング。
• 5'-OHおよび3'-リン酸を有する二本鎖DNA断片の調製。
• クロマチン構造の解析。
• 粗無細胞抽出液中の核酸の分解。
• ウサギ網状赤血球ライセートの調製。
• クロマチン構造研究。
• タンパク質フォールディングおよび構造・機能相関研究のための、実験室レベルのタンパク質調製物からの核酸除去。
• タンパク質フォールディング機構の研究。