MNase

関連する読書

紹介

マイクロコッカスヌクレアーゼ（Mnase）は、ヌクレオソーム接合部位のDNAのみを分解するヌクレアーゼであり、ヌクレオソームのDNAはヒストン1によって保護されているため分解されません。マイクロコッカスヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来であり、比較的非特異的なエンドエクソヌクレアーゼです。二本鎖、一本鎖、環状および線状の核酸を消化する組換えE. coli株から精製されます。この酵素はpH 7.0 - 10.0の範囲で活性があり、RNAおよびDNA基質に対して最適な活性はpH 9.2です。アデニレート、デオキシアデニレート、またはチミジレートが豊富な部位での切断の好みが観察されています。DNAとRNAはどちらも3'リン酸モノヌクレオチドおよびジヌクレオチドに分解されます。

出所

この酵素は、Staphylococcus aureusの細胞外ヌクレアーゼです。一般的な出所は、S. aureus細胞外ヌクレアーゼ（マイクロコッカスヌクレアーゼ）をコードするクローン核遺伝子を持つE. coli細胞です。

構造

マイクロコッカスヌクレアーゼ（当時はスタフィロコッカスヌクレアーゼとして知られていた）の3次元構造は、タンパク質結晶学の歴史の初期に解明され、アポ型の高解像度の新しい結晶構造が利用可能です。例えば、Protein Data Bankファイル1SNO:や、チミジン二リン酸抑制型のProtein Data Bankファイル3H6Mおよび1SNCなどです。ヌクレアーゼ分子は、3つの長いαヘリックスと5つのリンクされたバレル状のβラメラを持ち、OBフォールド（オリゴヌクレオチド結合フォールド）として知られる配置になっています。

マイクロコッカスヌクレアーゼ手順

• ターゲット遺伝子を取得する

1. PCR法による：ターゲット遺伝子を含むクローンプラスミドをテンプレートとして使用し、遺伝子配列に従ってプライマーのペアを設計し（異なる酵素部位が上流および下流のプライマーに導入されます）、PCRサイクルを実施して目的の遺伝子断片を取得します。
2. RT-PCR法による：TRIzol法で細胞または組織から総RNAを抽出し、mRNAをテンプレートとして使用し、逆転写してcDNAの第一鎖を形成し、逆転写産物をPCRサイクルのテンプレートとして使用して生成物を取得します。

• 組換え発現ベクターを構築する

1. マイクロコッカスヌクレアーゼベクターダイジェスション：発現プラスミドを制限内因性ヌクレアーゼ（同じプライマー部位）で二重消化し、消化産物をアガロース電気泳動で回収し、ベクターフラグメントをゲル回収キットまたは凍結融解法で回収します。
2. PCR産物は二重消化後に回収され、T4 DNAリガーゼによってベクターにライゲートされます。

• 組換え発現プラスミドを含む発現株を取得する

1. ライゲート産物をE. coli DH5αに形質転換し、マーカー（抗アンピシリンまたは青白スポット）に従って組換えベクターをスクリーニングし、単一スポットを選択し、アルカリ溶解法で少量のプラスミドを抽出し、予備同定のために二重消化を行います。
2. ターゲット遺伝子の挿入方向と読み枠が正しいことを確認するために配列決定を行い、次のステップに進みます。そうでない場合は、さらにクローンをスクリーニングし、サブクローニングを繰り返すか、異なる酵素部位にサブクローニングします。
3. この組換えプラスミドDNAを宿主細菌の受容体細胞に形質転換します。

• 発現の誘導

応用

• 細胞フリーの粗抽出物における核酸の加水分解。
• RNAシーケンシング。
• 5'-OHおよび3'-リン酸を持つ二本鎖DNA断片の調製。
• クロマチン構造の研究。
• 粗細胞フリー抽出物における核酸の分解。
• ウサギ網赤血球ライセートの調製。
• クロマチン構造の研究。
• タンパク質折りたたみおよび構造-機能研究のための実験室タンパク質調製物からの核酸の除去。
• タンパク質折りたたみメカニズムの研究。