L-グルタミン酸オキシダーゼ

L-グルタミン酸オキシダーゼは、極めて有用性の高いツール酵素となり得る酵素であり、その補酵素はフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）である（フラビンタンパク質）。基質としてL-グルタミン酸を用いると、高い基質特異性のもとで過酸化水素、アンモニアおよびα-ケトグルタル酸へと分解される。L-グルタミン酸オキシダーゼ（GLOD）は、FADを補酵素として利用するL-アミノ酸オキシダーゼであり、外因性補因子を添加しない条件下でも、L-グルタミン酸を脱アミノ化してα-ケトグルタル酸、アンモニアおよび過酸化水素を生成する。L-グルタミン酸オキシダーゼは、反応基質に対する高い特異性および高い親和性、温和な反応条件、高い触媒効率を有し、食品、工業発酵および製薬産業で広く利用されている。1980年代に発見されて以来、本酵素は国内外で研究のホットスポットとなっており、有望なツール酵素の一つである。現在まで、L-グルタミン酸オキシダーゼに関する国内外の研究の焦点は主として二つの側面に集中している。一つは、現行の観察・測定手法を用いて酵素の作用機序および構造を解明することである。もう一つは、高酵素生産性を有する高活性株の継続的な開発と、その評価・研究方法である。酵素特性を活用し、人々の生活および産業用途に資することが目的である。

図1．L-グルタミン酸オキシダーゼのタンパク質構造。

L-グルタミン酸オキシダーゼの由来

L-アミノ酸オキシダーゼは由来が豊富であり、ヘビ毒、多くの動物および微生物から単離可能である。微生物は由来の幅が広い一方で、酵素生産能は高くない。現時点の研究段階では、L-グルタミン酸オキシダーゼは主として微生物から単離されている。その中でも、Streptomyces（ストレプトマイセス属）は他株に比べて酵素生産能が高く、酵素生産量は6.4 U/mLに達する。L-グルタミン酸オキシダーゼの最初の発見は、JURTSHUKおよびMEMANUSによりA. veneziarumの膜画分調製物中で報告されたが、基質特異性を有していなかった。厳密な意味での最初の確認は、1983年にKAMEI TらがStreptomyces violascensの発酵液中にL-グルタミン酸オキシダーゼの存在を確認したものである。相対分子量は約60,000である。フラビンタンパク質に特徴的な吸収スペクトルを示し、外因性補助因子の関与を必要としないが、特異性は強くなく、L-グルタミン酸、L-グルタミンおよびL-ヒスチジンに作用する。

クレアチニン測定への応用

1993年、RUI C SらはL-グルタミン酸オキシダーゼを用いて、血中クレアチニン含量を測定するフローインジェクションシステムを構築した。本システムは二重チャネル測定を採用し、血中に内在するグルタミン酸およびアンモニアが測定に及ぼす影響を回避する。第1応答は内因性アンモニア、グルタミン酸およびクレアチニンの総応答であり、第2応答は内因性アンモニアおよびグルタミン酸の応答である。測定範囲はそれぞれ2 mmol/Lおよび3 mmol/Lに達する。本システムは安定性および再現性に優れ、化学的方法で得られたクレアチニン測定結果と良好な相関を示す。

バイオセンサーへの応用

L-グルタミン酸は、医薬、食品添加物、栄養補助食品等の分野で幅広い機能を有するが、1人当たりの1日摂取量は6 g/日を超えない。L-グルタミン酸の過剰摂取は明らかな中毒症状を引き起こし、頭痛、めまい、顔面の過度の発汗として現れる。したがって、食品および臨床検体中のL-グルタミン酸含量の検出は極めて重要かつ必要である。L-グルタミン酸の従来の検出法としては、電位差滴定、ワールブルグ呼吸測定法、およびクロマトグラフィー分析が一般的に用いられている。これらの方法は時間と労力を要し、高精度の高額機器を必要とする。そのため、L-グルタミン酸検出へのバイオセンサー適用を考慮すると、バイオセンサーは迅速性、高感度、装置の簡便性等の利点を有する。

結論

L-グルタミン酸オキシダーゼは比較的新しい実用的ツール酵素であり、その作用機序およびタンパク質の三次元構造に関する報告は限られている。近い将来、バイオテクノロジーおよび分子バイオテクノロジーの進展により、研究者がその作用機序を解明し、工業生産により適したエンジニアリング菌株を構築することで、より広範に利用され、人類の生産および生活に貢献することが期待される。

参考文献