グルコース脱水素酵素

グルコース脱水素酵素（Glucose dehydrogenase：GDH）は、補酵素NADP⁺をNADPHへ（または程度は低いもののNAD⁺をNADHへ）還元しつつ、β-D-グルコースをβ-D-グルコース-1,5-ラクトンへ酸化する反応を触媒する。本酵素は、Bacillus megaterium、Bacillus subtilis、Gluconobacter suboxydans、Halobacterium mediterranean、Acidophilus、Thiobacillusなど、多様な生物に存在する。GDHは補因子としてNADP⁺およびNAD⁺を受容するため、NADPHまたはNADHの再生系として有望である。これは、プロキラルなケトン化合物を不斉還元してキラルなヒドロキシ基を有する化合物、アミノ酸、アルコール等を製造する用途において重要であり、これらは重要物質の合成における原料・出発物質として位置付けられる。現在使用されている酸化還元酵素の多くはニコチンアミド系補酵素に依存している。NADHについては、ギ酸／ギ酸脱水素酵素（FDH）に基づく再生法が開発の最終段階に到達している。

図1．グルコース脱水素酵素のタンパク質構造。

グルコース脱水素酵素の構造と機能の関係

由来の異なるグルコース脱水素酵素は機能が類似している一方で、一次構造および立体構造には一定の差異が認められる。Bacillus megaterium由来およびBacillus subtilis由来のグルコース脱水素酵素の相同性を比較したところ、23箇所のトランジション、30箇所のトランスバージョン、1箇所の逆位、ならびに3箇所の挿入または欠失が認められたが、フレームシフトは認められなかった。両酵素サブユニットの相同性は85%であり、両者の進化的時間が近いことを反映している。

グルコース脱水素酵素の供給源

現在、国内外の研究者は主として、ウシ心臓および各種微生物の発酵により本酵素を取得している。供給源となる微生物としては、Bacillus megaterium、Bacillus subtilis、Bacillus pumilus、酢酸カルシウム固定化バチルス（Acinetobacter calcoaceticus）、好塩性古細菌、（Thermoacidophilis古細菌）などが挙げられる。トランスケトラーゼ欠損Bacillus subtilis由来のDHは酵素生産性が高く、精製が容易であることから、広く受け入れられ応用されている。

グルコース脱水素酵素の分離・精製および速度論的特性

現状、海外では一般に、遺伝子クローニングにより高生産DHを取得し、大腸菌（E. coli）発現宿主へ形質転換したうえで、微生物発酵により生産する方法が採用されている。DHは細胞内酵素であるため、酵素活性を評価するには、細胞破砕により無細胞抽出液を調製する必要がある。破砕効率および酵素タンパク質の特性を考慮し、国内では凍結融解法または超音波破砕法が用いられることが多い。一方、海外では高圧式セルディスラプター等の先進的手法が用いられる例もある。由来の異なるグルコース脱水素酵素は触媒活性が非常に類似しているものの、構造が異なるため、物性も当然ながら異なる。したがって、酵素に適した精製法を選択する必要がある。ブタ肝臓のβ2D2グルコース脱水素酵素は多機能酵素であり、TritorX2114により小胞体から分離でき、さらにアガロースゲルカラム上でNADP⁺に結合した酵素を、NAD⁺を用いて精製する。

用途

GDHの用途の一つはNADHの再生であり、文献上いくつかの例が報告されている。Bacillus属のGDHは、ウシ肝臓グルタミン酸脱水素酵素を用いた還元的アミノ化により、2-ケト-6-ヒドロキシヘキサン酸をL-6-ヒドロキシノルロイシンへ合成・変換する際に、NADH再生に用いられている。同様の目的でBacillus由来GDHが使用される。Pseudomonas putida IAM12014のL-カルニチン脱水素酵素は、3種のデヒドロカルニチンからL-カルニチンを生成する。GDHの別の用途はNADPHの再生である。4-クロロ-3-オキソ酪酸エチルを不斉還元するため、S. salmonellaのアルデヒド還元酵素をBacillus megateriumのGDHとカップリングし、NADPH再生系として共発現させた例がある。Gluconobacter sclerotiorum KY3613由来GDHは、L-葉酸生産における補因子回収に用いられている。6-リン酸グルコース脱水素酵素もNADPHを再生可能である。市販のグルコース6-リン酸脱水素酵素、およびLeptobacterium enteritidis由来グルコース6-リン酸脱水素酵素の再生系が使用された。Bacillus subtilis由来グルコース脱水素酵素と、NADP⁺依存性（R）特異的アルコール脱水素酵素（E. coliで過剰発現）をE. coliで過剰発現させ、立体選択的生産を実施した。E. coli細胞は十分な補因子再生系を有しないため、2遺伝子をE. coliで共発現させ、全細胞バイオトランスフォーメーションを行う共発現システムが開発された。

参考文献