GLDH

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序論

グルタミン酸脱水素酵素（GLDH、またはGDH）は六量体酵素であり、NAD(P)⁺をNAD(P)Hへ還元しつつ、グルタミン酸をα-ケトグルタル酸およびアンモニアへ可逆的に変換する反応を担う。GDHはクエン酸回路（TCA回路）へのアナプレロシスおよびエネルギー産生を促進することに加え、細胞内シグナル伝達およびレドックス恒常性とも密接に関連している。

細菌や酵母などの下等生物では、通常、異なるGDHアイソ酵素が発現しており、これらのアイソ酵素はNAD⁺またはNADP⁺に対して厳密な特異性を示す。NAD⁺依存性GDHは主として代謝機能を担い、NADP⁺特異的酵素は生合成機能に関与する。酵母Saccharomyces cerevisiaeでは、3種類のGDHアイソザイムが同定されている：yGDH1（NADP⁺特異性）、yGDH2（NAD⁺特異性）、yGDH3（NADP⁺特異性）。NAD⁺特異的アイソ酵素（yGDH2）は、グルタミン酸の酸化的脱アミノ化によりα-ケトグルタル酸およびアンモニアを生成する反応に関与し、NADP⁺特異的アイソ酵素（yGDH1、yGDH3）は主としてグルタミン酸生合成に関与する。下等生物におけるGDHの制御は転写レベルで達成される。Arabidopsis thalianaでは、NAD⁺特異的GDHは3つの異なる遺伝子（aGDH1、aGDH2、aGDH3）によりコードされる。Oryza sativa（イネ）においても、NAD⁺特異的oGDHは発現パターンの異なる3つの遺伝子によりコードされる。同時に、NADP⁺特異的GDHタンパク質も複数の高等植物で同定されている。哺乳類では、GDHは二重の補酵素特異性を有し、高度に制御される酵素へと進化している。哺乳類GDH1（ヒトではhGDH1）は異化および細胞合成の双方において重要な役割を果たし得る。さらにGDH1は、複雑なアロステリック制御系によっても調節されている。

図1．グルタミン酸脱水素酵素（GDH）経路とクエン酸回路の機能（Plaitakis, A.; et al. 2017）

構造

GDHは6つのサブユニットからなる六量体である。各ペプチドは約500アミノ酸残基から構成され、分子量は約56 kDaである。六量体酵素は2つの三量体からなり、各三量体はNAD⁺結合ドメイン、グルタミン酸結合ドメイン、調節ドメインの3つの機能ドメインを含む。三量体内では隣接サブユニットのアンテナ構造が相互に絡み合っており、このサブユニット間相互作用がアロステリーを媒介すると考えられているが、その正確な機序は十分に解明されていない。

近年、異なるGDHの高分解能X線結晶構造が取得されたことにより、触媒機能の分子機構に関する理解が大きく進展した。哺乳類GDH1（「アンテナ」を含む高度な構造）に関する最近の研究では、六量体構造が各触媒サイクルにおいて顕著なコンフォメーション変化を受けることが示されている。触媒クレフトが開く際、NAD⁺ドメインがグルタミン酸結合ドメインから離れ、アンテナを軸として時計回りに回転することが観察されている。これらの観察は、hGDH1において当該ヘリックス上に位置するアミノ酸変異がGTPによる阻害効果を減弱させ、高インスリン血症／高アンモニア血症（HI/HA）症候群を引き起こすことを示しており、この小ヘリックスの重要性を強調している。

図2．hGDH1の構造モデル（Plaitakis, A.; et al. 2017）

GDHの触媒反応

研究により、哺乳類GDHの熱力学的平衡はグルタミン酸合成を促進し得ることが示されているが、in vivoにおいて本酵素が酸化的脱アミノ化方向に作用するか否かは依然として不明である。GDHの触媒作用は、基質濃度、イオン強度、pH、および緩衝液組成の影響を受ける。哺乳類組織由来の精製GDHまたは組換えhGDH1を用いた研究では、本酵素の至適pH範囲は7.75～8.00であり、低pHではADPによる活性化が有意に低下することが示されている。hGDH2の至適pHは7.50であり、さらに低いpH（7.25～7.0）でも有効に機能し得る。アンモニアのKmが比較的高いことから、特にアンモニア濃度が通常低い組織では、GDHは酸化的脱アミノ化方向に作動すると予想される。

hGDH2と異なる部位におけるhGDH1の部位特異的変異導入により、アンテナの下降鎖に位置する単一の進化的アミノ酸置換（Arg443Ser）が触媒活性を低下させ、L-ロイシンによる活性化を消失させることが示された。さらに、Arg443Serの変化は酵素を熱不安定化し、ステロイドホルモンに対する感受性を増大させる。ヒトGDHの他の機能解析では、hGDH2の基礎活性がアッセイ中の組換え酵素濃度に依存することが示されている。野生型hGDH2およびhGDH1変異体における酵素タンパク質濃度依存性は、アンテナにおけるArg443–Ser409水素結合の破綻に関連すると考えられている。hGDH2およびhGDH1変異体の場合とは異なり、野生型hGDH1ではタンパク質濃度の変化が比活性に与える影響は小さい。