GK

関連する読書

はじめに

ほとんどの細菌では、グリセロールの取り込みは、膜チャネルタンパク質であるグリセロールファシリテーター（GlpF）によってエネルギー非依存的に触媒されます。グリセロール拡散の駆動力は、グリセロール代謝によって引き起こされる細胞内外のグリセロール濃度の不均衡から生じます。通常、グリセロールキナーゼ（GlpK）はトリオールをグリセロール-3-P（G3P）に変換し、G3PはGlpFによって基質として認識されないため、GlpKは細胞内でのグリセロールの捕獲に重要な役割を果たします。Firmicutes（グラム陽性）および腸内細菌科（グラム陰性）では、GlpKの合成は炭素カタボライト抑制によって制御され、酵素活性は糖リン酸転移系（PTS）によって調節されます。PTSは、5つのタンパク質（またはドメイン）のうち4つがリン酸供与体としてホスホエノールピルビン酸（PEP）を使用してリン酸化カスケードを形成する炭水化物輸送およびリン酸化系です。in vivo研究では、PTS糖の存在がPTSタンパク質のリン酸化を低下させ、グリセロールにおけるGlpKのリン酸化および活性化の程度を著しく減少させることが示されました。

驚くべきことに、これらの酵素は通常50%から60%の配列同一性を示しますが、GlpK活性を制御するメカニズムはFirmicutesと腸内細菌科でかなり異なります。E. coliのような腸内細菌科では、非リン酸化EIIA^GlcがGlpKと相互作用し、その活性を抑制することで、誘導体G3Pの生合成を防ぎます。EIIA^GlcとGlpKの相互作用は、グリセロール結合部位から約30Å離れたC末端ドメインで発生し、Zn²⁺イオンの存在によって刺激されます。FirmicutesのGlpKでは、活性化ループも活性部位から離れた位置にあり、結晶構造で示されています。Bacillus subtilisのいくつかの自発的変異は、機能的PTSがない状態でのグリセロール利用を引き起こします。B. subtilisのGlpKはHis-230でリン酸化されます。これらの発見は、前述の変異とGlpKリン酸化が酵素の活性化につながる類似の構造変化を引き起こすことを示唆しています。E. casseliflavusおよびB. subtilisから精製された変異体GlpKは、非リン酸化の野生型（WT）酵素よりも7倍から19倍高い活性を示しました。

図1. Enterococcus casseliflavus GlpK O-Xダイマーの概要 (Yeh, J.I.; et al. 2009)

触媒部位

グリセロールがGlpKに結合するのは順序反応であり、最初にグリセロールが結合し、その後ATPが結合します。ほとんどの研究はE. coliのGlpK酵素に対して行われましたが、触媒隙間残基の配列保存は生物間で見られ、GlpKの調節領域ではより大きな配列の多様性が見られました。したがって、さまざまなGlpK酵素の活性部位の構成と触媒メカニズムは類似している可能性があります。

グリセロールは、複数の残基への水素結合を通じて触媒隙間の奥深くに結合します。グリセロール結合触媒隙間のFo-Fcマップに明らかな強い電子密度は、サブユニットごとに1つのグリセロール分子の存在を支持します。His232Arg、His232Glu、およびHis232Alaの活性部位は、グリセロール結合部位の周りで強い類似性を共有し、活性部位のグリセロールとアミノ酸間の水素結合距離は0.2Å未満の差があります。活性部位では、Glu85の助けを借りて、Arg84、Asp 246、およびTyr136が結合したグリセロールを固定し、整列させる役割を果たします。残基Trp104およびPhe271は、グリセロールの炭素と相互作用する疎水性表面を提供し、グリセロールをさらに整列させます。すべてのGlpK構造における活性部位残基の向きの類似性は、活性の違いが触媒隙間でのグリセロール結合の直接的な変化によるものではないことを示唆しています。

GlpKが基質に結合すると、触媒隙間が閉じ、ドメインIとIIが近づきます。グリセロールは触媒隙間の奥深くに結合し、推定ATP結合部位は触媒隙間の入口に位置しています。グリセロールは活性部位で容易に識別されますが、His232Arg、His232Arg-B、およびHis232Gluの差分密度マップには、四面体分子がグリセロールに近接しており、グリセロールとATP結合部位を橋渡しする位置にあることを示す追加の有意な正の残留電子密度が見つかりました。各タンパク質の結晶化条件に基づき、リン酸イオンはHis232Arg密度としてモデル化され、硫酸イオンはHis232GluおよびHis232Arg-Bに配置されました。精製後、リン酸基はグリセロールO3原子から4.4Å離れ、硫酸は4.8Å（His232Glu）および3.5Å（His232Arg-B）です。

図2. His232ArgおよびHis232Glu GlpK変異体におけるグリセロール結合部位 (Yeh, J.I.; et al. 2009)