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GK
背景
グリセロールキナーゼは、トリグリセリドおよびグリセロリン脂質の生合成に関与するホスホトランスフェラーゼ酵素である。グリセロールキナーゼは、MgATP依存的にグリセロールのリン酸化を触媒してsn-グリセロール-3-リン酸を生成し、グリセロール利用における律速酵素である。また、フルクトース-1,6-ビスリン酸によるフィードバック制御を受ける。
同義語
EC 2.7.1.30；グリセロールキナーゼ；GK；ATP：グリセロール-3-リン酸ホスホトランスフェラーゼ；グリセロールキナーゼ（リン酸化）；グリセリン酸キナーゼ；9030-66-4
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序論

多くの細菌において、グリセロールの取り込みは、膜チャネルタンパク質であるグリセロールファシリテーター（GlpF）により、エネルギー非依存的に触媒される。グリセロール拡散の駆動力は、グリセロール代謝により生じる細胞内外のグリセロール濃度不均衡に由来する。一般に、グリセロールキナーゼ（GlpK）はトリオールをグリセロール-3-リン酸（G3P）へ変換し、G3PはGlpFの基質として認識されないため、GlpKは細胞内でのグリセロール捕捉において不可欠な役割を担う。Firmicutes（グラム陽性）および腸内細菌科（グラム陰性）では、GlpKの合成は炭素カタボライト抑制により制御され、酵素活性は糖ホスホトランスフェラーゼ系（PTS）により調節される。PTSは糖の輸送およびリン酸化系であり、5つのタンパク質（またはドメイン）のうち4つがホスホエノールピルビン酸（PEP）をリン酸供与体として用い、リン酸化カスケードを形成する。in vivo試験では、PTS糖の存在によりPTSタンパク質のリン酸化が不十分となり、さらにグリセロール存在下でのGlpKのリン酸化および活性化の程度が有意に低下した。

驚くべきことに、これらの酵素は通常50～60%の配列同一性を示すにもかかわらず、GlpK活性を制御する機構はFirmicutesと腸内細菌科で大きく異なる。E. coliなどの腸内細菌科では、非リン酸化EIIAGlcがGlpKと相互作用してその活性を阻害し、誘導体であるG3Pの生合成を抑制する。EIIAGlcとGlpKの相互作用は、グリセロール結合部位から約30 Å離れたC末端ドメインで生じ、Zn2+イオンの存在により促進される。FirmicutesのGlpKでは、結晶構造に示されるとおり、活性化ループも活性部位から離れた位置に存在する。Bacillus subtilisでは、機能的PTSが存在しない条件下でもグリセロール利用を可能にする自発変異が複数同定されている。B. subtilisのGlpKはHis-230でリン酸化される。これらの知見は、前述の変異およびGlpKリン酸化が、酵素活性化に至る同様の構造変化を引き起こすことを示唆する。E. casseliflavusおよびB. subtilis由来の変異体GlpKを精製して評価したところ、非リン酸化野生型（WT）酵素と比較して7～19倍高い活性を示した。

Overview of the Enterococcus casseliflavus GlpK O-X Dimer 図1. Enterococcus casseliflavus GlpK O-X二量体の概観（Yeh, J.I.; et al. 2009）

触媒部位

グリセロールのGlpKへの結合は順序反応であり、まずグリセロールが結合し、その後にATPが結合する。多くの研究はE. coliのGlpK酵素で実施されているが、触媒クレフト残基は生物種を超えて保存されている一方、GlpKの調節領域ではより大きな配列多様性が認められる。したがって、各種GlpK酵素の活性部位構成および触媒機構は類似している可能性がある。

グリセロールは、複数残基との水素結合により触媒クレフト深部に結合する。グリセロール結合触媒クレフトのFo-Fcマップに認められる強い電子密度は、サブユニット当たり1分子のグリセロールが存在することを支持する。His232Arg、His232Glu、His232Alaの各活性部位はグリセロール結合部位周辺で強い類似性を示し、活性部位におけるグリセロールとアミノ酸間の水素結合距離の差は0.2 Å未満である。活性部位では、Glu85の補助のもと、Arg84、Asp246およびTyr136が結合グリセロールの固定および配向に寄与する。残基Trp104およびPhe271は疎水性表面を提供してグリセロール炭素と相互作用し、グリセロールの配向をさらに安定化する。すべてのGlpK構造における活性部位残基の配向が類似していることから、活性差は触媒クレフトにおけるグリセロール結合の直接的変化に起因しないことが示唆される。

GlpKが基質に結合すると触媒クレフトが閉鎖し、ドメインIおよびIIが互いに近接する。グリセロールは触媒クレフト深部に結合し、推定ATP結合部位は触媒クレフト入口に位置する。活性部位ではグリセロールが容易に同定される一方、His232Arg、His232Arg-BおよびHis232Gluの差電子密度マップにおいて、追加の有意な正の残差電子密度が認められ、四面体分子がグリセロール近傍、すなわちグリセロール結合部位とATP結合部位を架橋する位置に存在することが示された。各タンパク質の結晶化条件に基づき、His232Argの密度にはリン酸イオンをモデル化し、His232GluおよびHis232Arg-Bには硫酸イオンを配置した。精密化後、リン酸基はグリセロールのO3原子から4.4 Å離れており、硫酸は4.8 Å（His232Glu）および3.5 Å（His232Arg-B）であった。

Glycerol Binding Site in His232Arg and His232Glu GlpK Mutants 図2. His232ArgおよびHis232Glu GlpK変異体におけるグリセロール結合部位（Yeh, J.I.; et al. 2009）

References

  1. Yeh, J.I.; et al. Structural Characterizations of Glycerol Kinase: unraveling phosphorylation-induced long-range activation. Biochemistry. 2009.
  2. Charrier, V.; et al. Cloning and sequencing of two enterococcal glpK genes and regulation of the encoded glycerol kinases by phosphoenolpyruvate-dependent, phosphotransferase system-catalyzed phosphorylation of a single histidyl residue. J. Biol. Chem. 1997.
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