ガラクトースオキシダーゼ

ガラクトースオキシダーゼ（GO、GAO、EC 1.1.3.9）は単核銅酵素であり、多数の第一級アルコールを対応するアルデヒドへ二電子酸化する反応を触媒するとともに、分子状酸素を過酸化水素へ還元する反応と共役して進行する。本タンパク質は分子量65～68 kDaの単一ポリペプチドからなる。GOは3つの明確な酸化状態をとり得る。すなわち、Cu(II)とチロシルラジカルを有する最高酸化状態、Cu(II)とチロシンを有する中間酸化状態、ならびにCu(I)とチロシンを有する最低酸化状態である。GAOは、ガラクトースおよび乳糖などガラクトース含有糖類を検出するバイオセンサーやその他の分析手法において利用可能である。化学合成用途では、GAO触媒酸化により多様な新規の単糖、オリゴ糖および多糖誘導体が調製されている。

構造

ガラクトースオキシダーゼの構造は広範に研究されている。ガラクトースオキシダーゼは639アミノ酸残基からなり、3つのドメインを有する。単一の銅(II)イオンはβプロペラドメイン表面近傍の部位、擬似7回対称軸に近い位置に存在する。ドメイン1（残基1～155）は8本の逆平行βストランドからなるβサンドイッチ構造である。Na⁺またはCa²⁺の結合部位となり得る領域を含み、タンパク質の構造維持に寄与する可能性がある。ドメイン1のもう一つの特徴として、酵素が細胞外糖鎖に結合することを指向する糖質結合部位の存在が挙げられる。ドメイン2（残基156～552）には銅結合部位が含まれる。ドメイン2のβストランドは7枚羽根のプロペラとして配置され、7つの構造ユニットそれぞれが4本の逆平行βストランドからなるサブドメインを形成する。ドメイン3（残基553～639）は7本の逆平行βストランドからなり、ドメイン2の上に「キャップ」を形成する。ドメイン3のヒスチジン1残基（His581）が銅の配位子として機能し、金属含有活性部位の形成に寄与する。

pH 4.5の酢酸緩衝液中で得られた結晶形では、銅部位は正方錐型配位を示し、Tyr272、His496、His581および酢酸イオンが赤道位配位子、Tyr495が軸位配位子となる。活性部位には、Tyr272環のC炭素の一つとCys228のSγとの間に特異なチオエーテル結合が存在する。Tyr272およびCys228の共平面側鎖がTrp290のインドール環とスタッキングすることで、拡張した芳香族領域が形成される。pH 4.5の酢酸中で成長させた結晶を、酢酸を含まないpH 7.0の緩衝液へ移した場合、銅部位の構造は酢酸イオンが水に置換される点を除き、本質的に変化しない。

作用機序

本酵素は、一般式RCH₂OH+O₂→RCHO+H₂O₂に従う二電子酸化還元反応を触媒する。ガラクトースオキシダーゼの触媒機構は4つの主要段階からなる。第1段階では、基質が二重の酸化還元中心により酸化される。溶媒配位部位が基質アルコールのヒドロキシル基に占有された後、Tyr495によりヒドロキシル基が脱プロトン化され、続いてTyr495が解離する。この段階によりアルコールは酸化されやすくなる。次いで、結合炭素上のプロトンが、基質の酸化と共役してTyr272へ移動する。電子の一つは銅(II)中心へ移動して銅(I)へ還元し、もう一つはラジカル配位子へ移動する。同時にTyr272ラジカルも還元される。第1段階の結果として、基質から2電子が除去され、2個の水素原子が除去される。第2段階は、酸化された基質の放出と、基質配位部位への分子状酸素の配位である。第3段階では、銅(I)により分子状酸素が迅速に還元され、スーパーオキシドが生成する。第4段階では、ヒドロペルオキシドによりTyr496が脱プロトン化され、H₂O₂として放出される。その後、Tyr496の軸位配位および新規基質分子の銅中心への赤道位配位により、酵素のターンオーバーが完結する。

図2．ガラクトースオキシダーゼの触媒機構。

GAO触媒酸化の主生成物がガラクトアルデヒドであることは明らかである。しかし、副生成物も複数生成し得る。例えば、GAOによるメチルα-D-ガラクトピラノシドの72時間酸化後、生成物の27%は同定できなかった。別の研究では、α,β-不飽和アルデヒドなど、いくつかの副生成物が同定・特性解析されている。GAO由来の副生成物の生成に加え、主生成物であるアルデヒドは反応性が高いため、可逆反応により水和物およびヘミアセタールを形成する。この現象は、特に酸化度を定量する際に考慮する必要がある。

応用

GAOを用いたバイオセンサー研究では、さまざまな固定化手法が用いられている。例えば、Pt電極表面に被覆したラポナイト粘土膜内にGAOを固定化し、多目的アンペロメトリックセンサーを構築した例がある。架橋化合物としてジイソチオシアネートスチルベンを用いることで、GAOをAuまたはAg表面上のアミノ化チオール単分子膜に固定化した例もあり、この場合スチルベンがGAOおよびチオール被覆の双方のアミノ基間に架橋を形成する。

ガラクトースはヒトにとって必須栄養素ではないが、エネルギー源として利用され得るほか、糖脂質や糖タンパク質など一部生体分子の生合成にも利用される。したがって、ガラクトース代謝に関与する酵素の欠損は、肝脾腫、出血性障害、大腸菌敗血症、白内障などの健康障害を引き起こし得る。このため、特に血清試料を対象としたガラクトースバイオセンサーが開発されている。GAOベースのバイオセンサーは、タンパク質のグリコシル化の研究も促進してきた。固定化GAOによりガラクトース末端グリカンを酸化して標識し、その後NaBD₄で還元してLC-MSで解析する、あるいはアミノオキシビオチンで標識してMS/MSで解析することが可能である。同様のアプローチは、グリカン発現の化学発光イメージングにも用いられている。

GAOの環境用途としては、O2除去が挙げられる。これは、水または土壌中の硝酸イオンを電気化学分析によりオンサイトでモニタリングする際に必要となる。硝酸イオンは嫌気条件下で硝酸還元菌により消費されるためである。適切な基質およびカタラーゼとともにGAO、グルコースオキシダーゼ、またはピラノース2-オキシダーゼを添加することで、試料中のO2を1時間で完全に除去できた。

参考文献