ガラクトースオキシダーゼ

ガラクトースオキシダーゼ（GO、GAO、EC 1.1.3.9）は、一次アルコールの多くを対応するアルデヒドに二電子酸化する触媒であり、二酸化酸素を過酸化水素に還元する単核銅酵素です。このタンパク質は、分子量65-68 kDaの単一ポリペプチドです。GOは、Cu(II)とチロシルラジカルの最高状態、Cu(II)とチロシンの中間状態、Cu(I)とチロシンの最低状態の3つの異なる酸化状態で存在することができます。GAOの利用は、ガラクトースや乳糖などのガラクトース含有糖類を検出するバイオセンサーやその他の分析技術で実現可能です。化学合成の応用においては、GAO触媒による酸化によってさまざまな新しいモノ、オリゴ、ポリ糖誘導体が調製されています。

構造

ガラクトースオキシダーゼの構造は広範に研究されています。ガラクトースオキシダーゼは639のアミノ酸を含んでいます。β-プロペラードメインの表面近くに位置する単一の銅(II)イオンを持つ3つのドメインがあります。ドメイン1（残基1-155）は、8つの逆平行βストランドからなるβ-サンドイッチです。これは、タンパク質内で構造的役割を果たす可能性のあるNa⁺またはCa²⁺の結合部位を含んでいます。ドメイン1のもう一つの特徴は、酵素が細胞外の炭水化物に結合するように導く炭水化物結合部位の存在です。ドメイン2（残基156-552）は、銅結合部位を含んでいます。ドメイン2のβストランドは七重のプロペラとして整理されており、7つの構造単位のそれぞれは4つの逆平行βストランドからなるサブドメインです。ドメイン3（残基553-639）は、7つの逆平行βストランドからなり、ドメイン2の上に「キャップ」を形成します。ドメイン3の1つのヒスチジン（His581）は銅のリガンドとして機能し、酵素の金属含有活性部位に寄与します。

pH 4.5の酢酸バッファーで成長した結晶形は、銅部位が正方錐形であることを示し、Tyr272、His496、His581、および酢酸イオンが赤道リガンドとして、Tyr495が軸リガンドとして存在します。活性部位のTyr272環のC炭素の1つとCys228のSgとの間には異常なチオエーテル結合が存在します。Tyr272とCys228の共平面側鎖がTrp290のインドール環とスタッキングすることによって、拡張された芳香族領域が形成されます。pH 4.5の酢酸で成長した結晶を酢酸のないpH 7.0のバッファーに移した場合、銅部位の構造は基本的に変わらず、酢酸イオンが水に置き換わるだけです。

作用機序

この酵素は、一般的なスキームに従って二電子の酸化還元反応を触媒します：RCH₂OH+O₂→RCHO+H₂O₂。ガラクトースオキシダーゼの触媒メカニズムは、4つの主要な段階から成ります。最初の段階では、基質が二重酸化還元中心によって酸化されます。基質アルコールの水酸基が基質の水酸基によって溶媒配位部位が占有された後、Tyr495によって脱プロトン化され、その後Tyr495が放出されます。このステップにより、アルコールは酸化されやすくなります。結合された炭素に使用される炭素のプロトンは、基質の酸化と組み合わせてTyr272に転送されます。1つの電子は銅(II)中心に移動し、銅(I)に還元され、もう1つの電子はラジカルリガンドに移動します。一方、Tyr272ラジカルも還元されます。最初の段階の結果は、基質から2つの電子と2つの水素原子の除去です。第二段階は、酸化された基質の放出と基質配位部位での二酸化酸素の配位です。第三段階は、銅(I)による二酸化酸素の迅速な還元で、スーパーオキシドを形成します。第四段階は、過酸化水素によるTyr496の脱プロトン化で、H₂O₂として放出されます。その後、Tyr496の軸配位と新しい基質分子の赤道配位が銅中心に対する酵素の回転を完了させます。

図2. ガラクトースオキシダーゼの触媒メカニズム。

GAO触媒による酸化の主な生成物がガラクトアルデヒドであることは明らかです。しかし、いくつかの副生成物も形成される可能性があります。例えば、GAOによるメチルα-D-ガラクトピラノシドの72時間の酸化の後、27%の生成物が特定できませんでした。他の研究では、いくつかの副生成物が特定され、特徴付けられています。例えば、α,β-不飽和アルデヒドなどです。GAO生成の副生成物の形成に加えて、主なアルデヒド生成物の高い反応性は、可逆反応によって水和物やヘミアセタールの形成を引き起こします。この現象は、特に酸化の程度を定量化する際に考慮する必要があります。

応用

GAOを使用したバイオセンサー研究では、さまざまな固定化技術が使用されています。例えば、GAOは、Pt電極表面にコーティングされたラポナイト粘土フィルム内に固定化され、多目的アモペロメトリックセンサーが構築されました。ジイソチオシアネートスチルベンを架橋化合物として使用し、GAOはAuまたはAg表面のアミン化チオールの単分子層に付着され、スチルベンがGAOとチオールコーティングのアミノ基の間に架橋を形成します。

ガラクトースは人間にとって必須栄養素ではありませんが、エネルギー源や糖脂質や糖タンパク質などのいくつかの生体分子の生合成に利用されることがあります。したがって、ガラクトースの代謝に関与する酵素の欠乏は、肝脾腫、出血障害、大腸菌敗血症、白内障などの健康問題を引き起こす可能性があります。したがって、特に血清サンプル用のガラクトースバイオセンサーが開発されています。GAOベースのバイオセンサーは、タンパク質の糖鎖化の調査も促進しました。固定化されたGAOは、ガラクトース末端の糖鎖を酸化し、NaBD₄によって還元され、LC-MSで分析されるか、アミノオキシビオチンで標識され、MS/MSで分析されました。類似のアプローチは、糖鎖発現の化学発光イメージングにも使用されています。

GAOの環境応用には、O2除去が含まれます。これは、嫌気条件下で硝酸還元細菌によって消費されるため、水や土壌中の硝酸イオンの現場監視に必要です。GAO、グルコースオキシダーゼ、またはピラノース2-オキシダーゼを適切な基質とカタラーゼと共に添加することで、サンプルからO2を完全に除去することができました。

参考文献