ATPスルフリラーゼ

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序論

硫酸還元菌（Sulfate Reducing Bacteria：SRB）は、地球上で最も古い酵素反応経路の一つである、硫酸（SO4^2-）を硫化物（S^2-）へと異化的に還元する経路に関与する。SRBの中には、一部の細菌および古細菌が、好気条件下での代謝において硫酸を終末電子受容体として利用できるものがある。亜硫酸（SO3^2-）は、硫酸の還元過程を媒介する中間体として機能する。SRBは、生物地球化学的な硫黄循環および芳香族汚染物質の生分解において重要な役割を担い、土壌中の重要プロセス（例：水銀のメチル化等）の調節因子としても利用され得る。

硫酸を陰イオン性硫化物へ異化的に還元する経路には、細胞質に局在する3つの酵素が関与する：ATPスルフリラーゼ（ATP Sulfurylase：ATPS）、アデノシン5′-ホスホ硫酸（APS）レダクターゼ（APS Reductase：APSR）、および異化的亜硫酸レダクターゼ（dissimilatory sulfite reductase：dSIR）である。このうちATPSは、SO4^2--AMP結合の形成を担い、硫酸陰イオンをアデノシン5′-ホスホ硫酸（APS）へ活性化する反応を触媒する。この種のSO4^2-活性化が必要とされる理由は、硫酸が非常に低い酸化還元電位を有し、有機酸や分子状水素によって直接還元されないためである。本代謝経路により放出される硫化物は、SRBの生息環境に存在する金属構造物の腐食を引き起こし得る。真核生物ならびに一部の細菌・藻類の同化経路では、ATPS反応で生成するAPSがAPSキナーゼの基質となり、3′位がリン酸化されて3′-ホスホアデノシン5′-ホスホ硫酸（PAPS）を生成する。PAPSは、多様な含硫化合物に対するスルフリル基供与体として機能する。また、PAPSはシステイン生合成に必要な硫化物へ還元され得るが、システインはメチオニンの硫黄供与体となり得る。後生動物では、菌類および一部の藻類におけるATPSとAPSキナーゼが、PAPSシンターゼと呼ばれるタンパク質に集合している。微細藻類では多様なATPSアイソフォームが見出されており、海藻および淡水藻類におけるATPSアイソフォームの多様性は、硫酸利用可能性の異なる環境における生存がATPS酵素の進化に影響し得ることを示唆する。

ATPスルフリラーゼの結晶構造

ATPSは自然界に広く存在する酵素であり、ATPを用いて硫酸の活性化を可逆的に触媒し、APSおよびピロリン酸陰イオンを生成する。SRB、酵母および植物由来のATPSはいずれも、単量体または同種オリゴマー構造として特徴付けられている。ATPS-APS複合体の構造は、以下の生物種で報告されている：ダイズ（PDBコード：4MAF）、Penicillium chrysogenum（PDBコード：1I2D）、Saccharomyces cerevisiae（PDBコード：1G8H、1G8G、1JEE）、およびThermus thermophillus（PDBコード：1V47）。Penicillium chrysogenum（PDBコード：1I2D）と同様に、Saccharomyces cerevisiae由来ATPS（PDBコード：1G8H）の四次構造は、2つの三量体リングが60°のねじれを伴って積層した同種六量体アセンブリであることが示されている（図1）。ATPスルフリラーゼの結晶構造では、活性部位に4つの保存モチーフが観察される：QXRN（Gln195-Thr196-Arg197-Asn198）、HXXH（His201-Arg202-Ala203-His204）、VGRDHAG（Val288-Gly289-Arg290-Asp291-His292-Ala293-Gly294）、およびPFR（Pro327-Phe328-Arg329）である。

図1．20 nsの分子動力学（MD）シミュレーション後に得られたATPS-APS-Mg2+-ピロリン酸複合体の六量体構造；B．既知のATPS配列において観察される4つの保存モチーフ。1G8H結晶構造に提示（Wójcik-Augustyn, A.; et al. 2019）

ATPS触媒反応の仮説

Saccharomyces cerevisiaeおよびPenicillium chrysogenum由来ATPSの結晶学的研究により、ATP結合が六量体ATPS構造に顕著な変位を引き起こし得ることが示された。ATPSはアロステリック酵素であり、少なくとも2つのコンフォメーションを取り得ることが見出されている：基質に対する親和性が高いR状態と、アロステリック阻害因子が優先的に結合するT状態である。ATP結合によりPhe328側鎖が変位し、ATPSはR状態へ移行する。活性部位領域を含むドメインIIのフォールディングは、ATPSがα/βホスホジエステラーゼ・スーパーファミリーに属する可能性を示唆する一方で、プロトマーのアーキテクチャおよび単一タンパク質鎖内に存在する独立したトポロジーは、ATPSが新規のα/βタンパク質クラスを代表し得ることも示している。Escherichia coli K12由来ATPSに関する同位体トラッピング、質量分析および速度論的研究に基づき、ATPSが反応を触媒する機序に関する仮説が提唱されている。E. coliのATPSは、cysDおよびcysN遺伝子にコードされるヘテロ二量体から構成される四量体である。同位体トラッピング実験は、E. coliにおけるATPS反応がGTP依存性の2段階プロセスであることを示している。まず、酵素-AMP無水物中間体とピロリン酸が形成され、次いでピロリン酸の解離後に硫酸陰イオン（SO4^2-）が活性部位へ進入してAPSを形成する。ただし、AMP中間体の生成はGTP依存性であり、硫酸の添加により阻害される点は特筆すべきである。Saccharomyces cerevisiae由来ATPS-APS-PPi結晶構造に基づきSYBYLでモデリングされたATP分子の馬蹄形コンフォメーションは、硫酸分子によるインライン型求核攻撃を引き起こし得ると考えられる。

図2．AMP無水物中間体を経由するATPSの2段階SN-1反応機構の提案（Wójcik-Augustyn, A.; et al. 2019）

図3．モデリングされたATPS-ATP-硫酸構造に基づく、ATPSの1段階SN-2反応機構の提案（Wójcik-Augustyn, A.; et al. 2019）