ウレアーゼ

ウレアーゼ（EC 3.5.1.5）は加水分解酵素に属し、アミド加水分解酵素およびホスホトリエステラーゼ・スーパーファミリーの一員である。ウレアーゼの系統名は尿素アミド加水分解酵素であり、ニッケル含有酵素である。ウレアーゼは金属酵素で、植物、真菌、細菌に存在するが、動物には存在しない。ウレアーゼは活性部位に2個のNi²⁺イオンを有し、尿素の加水分解を触媒してアンモニアとカルバメートを生成する。ウレアーゼは生化学の歴史において2つの重要な意義を有する。第一に、ウレアーゼの結晶化により、酵素がタンパク質性であることが実証された。第二に、ニッケルの生物学的意義が認識された。

構造

X線結晶構造解析により、植物および細菌のウレアーゼはいずれも共通の三量体構造を共有することが示されているが、モノマーまたは機能単位を形成するポリペプチド鎖の数は異なる。植物および真菌のウレアーゼの機能単位は単一のポリペプチド鎖（α）である一方、細菌のウレアーゼの機能単位は2本（αおよびβ、Helicobacterのみに認められる）または3本（α、β、γ）のポリペプチド鎖から構成される。植物ウレアーゼで最も豊富な構造は三量体の二量体（α₃）₂であり、一部の植物および真菌のウレアーゼは二量体／三量体／四量体である。細菌ウレアーゼは三量体（αβγ）₃であり、Helicobacter pyloriのウレアーゼは二量体の三量体からなる四量体（[αβ]₃）₄である。前核ウレアーゼの小サブユニットのアミノ酸配列は、真核生物ウレアーゼの単鎖における対応領域と共線的である。

Figure 1. ウレアーゼの構造（Kappaun K. 2018）

触媒機構

ウレアーゼの活性部位は、2個のニッケル原子、カルバミル化リシン1残基、ヒスチジン4残基、およびアスパラギン酸1残基から構成される。カルバミル化リシンの架橋により2個のニッケル原子が連結され、Ni(1)は2つのヒスチジンにより配位され、Ni(2)は他の2つのヒスチジンおよび1つのアスパラギン酸残基により配位される。水酸化物イオンの架橋が2つのNi原子を連結し、さらに他の3つの末端水分子とともに、活性部位において水素結合した四面体状の水クラスターを形成する。触媒反応では、まず尿素が活性部位の3つの水分子と置換し、その後、尿素はカルボニル酸素を介してNi(1)と結合することで、尿素の炭素をより求電子的にし、求核攻撃を受けやすくする。続いて尿素はアミノ窒素原子を介してNi(2)とも結合し、ウレアーゼと二座配位結合を形成する。この結合により、水分子によるカルボニル炭素への求核攻撃が促進され、四面体中間体が形成され、そこからNH₃およびカルバメートが遊離する。

Figure 2. ウレアーゼの触媒機構（Kappaun K. 2018）

ウレアーゼの活性化

尿素分解活性を発現するためには、ウレアーゼの活性部位へのニッケルイオンの挿入に加え、リシン残基のカルバモイル化が必要である。細菌では、4つの補助タンパク質（UreD、UreF、UreG、UreE）がウレアーゼ活性金属中心の組み立てに関与する。ウレアーゼの活性化は、まずUreDがアポ・ウレアーゼのオリゴマーに結合し、活性化複合体形成の足場として機能することから開始される。次いでUreFが（UreABC–UreD）₃に結合し、GTPアーゼ活性化タンパク質として作用する。最後にUreGが結合することで複合体の形成が完了する。UreGは本質的に無秩序な酵素であり、GTPアーゼとしてウレアーゼ成熟過程に必要なエネルギーを供給する。GTPが加水分解されると、ニッケル結合シャペロンであるUreEが（UreABC–UreD）₃へ金属イオンを供給する。補助タンパク質に関する構造情報の蓄積に伴い、この活性化モデルはさらに改良された。新しい活性化モデルでは、Ni²⁺と結合したUreEがアポUreGに結合してUreGによるGTP取り込みを促進し、Ni²⁺はUreEからUreGへ移送される。続いて（UreDF）₂複合体がNi²⁺-UreGをめぐってUreEと競合し、超複合体であるアポ・ウレアーゼ／Ni²⁺-(UreDFG)₂を形成する。最終的に、KHCO₃/NH₄HCO₃がUreGによるGTP加水分解を触媒し、ウレアーゼの活性化が完了する。

ウレアーゼ阻害剤

ウレアーゼ阻害剤の研究には主に2つの目的がある。1つは触媒部位の作用機序を理解することであり、もう1つは、特定の状況においてウレアーゼが触媒する尿素加水分解を抑制し得る有効な阻害剤を見出すことである。ウレアーゼには、硫黄化合物、ヒドロキサミン、リン化合物、フッ化物、キノン、ポリフェノールなど、多様な阻害剤が存在する。チオールは競合的にウレアーゼを阻害する。アセトヒドロキサム酸は、ウレアーゼに対する遅延結合型の競合阻害剤であり、尿路結石の低減および尿路感染症の治療に用いられる。リン酸およびホスホロチオエートの誘導体は強力なウレアーゼ阻害剤である。リン酸はpH依存性のウレアーゼ競合阻害剤で、pH 5.0～8.0の範囲で作用するが、pH 7.5～8.0を超えると作用はほとんど認められない。フッ化物もpH感受性阻害剤である。キノンに関する研究では、一般的な遅延結合型で濃度依存的な機序が示された。キノンは、活性部位に保存されているシステイン残基を共有結合的に修飾することによりウレアーゼを阻害し、また、そのチオール基のアリール化および酸化によっても阻害し得る。

応用

ウレアーゼにより微生物は尿素を唯一の窒素源として利用できる。ウレアーゼの合成は恒常的である場合もあれば、環境pHの低下に対抗する細菌のストレス応答として誘導される場合もある。ヒト腸内細菌叢のウレアーゼは、体内で産生される尿素全体の最大30%を加水分解する。微生物由来ウレアーゼは歯科衛生においても重要である。口腔内微生物のウレアーゼによる唾液中尿素の分解で生成されるアルカリは、う蝕およびプラークの形成を抑制し得る。反芻動物では、動物由来尿素が前胃において細菌ウレアーゼにより分解され、ルーメン微生物叢の窒素源としてアンモニアが放出され、これがバイオマスとして動物に供給される。

参考文献