転移酵素

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これまでに特性解析されたDNAポリメラーゼのほぼすべては、各伸長イベントを誘導するためにDNAまたはRNAを鋳型として用い、成長中のプライマーにモノヌクレオチドを取り込む反応を特異的に触媒する。しかし、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（terminal deoxynucleotidyl transferase：TdT）と呼ばれる特異なDNAポリメラーゼが存在し、これは一本鎖DNAのみを基質として利用する。TdTはゲノム物質をde novoに生成し得る独自の能力を有し、研究者にとって最も魅力的なDNAポリメラーゼの一つとなっている。TdTは哺乳類で非常に早期に同定されたにもかかわらず、DNA合成を触媒する酵素の中でも依然として理解が最も進んでいないものの一つである。

図1．TdTの触媒過程（Deshpande, S.; et al. 2019）

過去数十年にわたり、本酵素の異なるmRNAスプライシングバリアントがウシ、マウス、ヒトで同定され、広範に検討されてきた。これまでのところ、マウスではTdTのスプライスバリアントが2種観察されている一方、ウシおよびヒトではそれぞれ3種が報告されている。

マウスで同定されたTdTの2つのスプライスバリアントは、TdTS（509アミノ酸からなる短鎖型）およびTdTL（529残基からなる長鎖型）である。TdTSは抗原受容体遺伝子に対し、鋳型非依存的かつバイアスの少ないヌクレオチド付加を触媒する一方、TdTLは3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するとされる。しかし、TdTLはエキソヌクレアーゼ活性を持たず、in vitroではTdTSとほぼ同等の酵素活性を示すとする見解もある。この制御機構は未解明であるものの、これらのデータは、マウスの2つのTdTアイソフォームの機能が、抗原受容体可変領域の完全性を維持しつつ抗原レパートリーの多様性を平衡化することにあることを示唆している。ヒト（h）およびウシ（b）のTdTアイソフォームはさらに複雑で、いずれもTdTS（短鎖型）、TdTL1（長鎖型）、TdTL2（長鎖型）と命名された3つの選択的スプライスバリアントを有する。

TdTの由来および精製

TdTは1971年に子ウシ胸腺から初めて精製された。当初、単離されたタンパク質はプロテアーゼ分解を受けた形態と考えられ、αおよびβサブユニットからなるヘテロ二量体として同定された2つのペプチドを含むとされた。しかし、その後の研究により、TdTは分子量58,000～60,000ダルトンの単量体タンパク質であることが確認された。一方で、加水分解を受けやすいため、完全長で高活性の酵素を得ることは非常に困難である。大量のTdTは、急性リンパ芽球性白血病患者由来の培養細胞株から精製可能であるが、本手法は大量生産にはコストが高すぎる。現在、TdTは主としてカラムクロマトグラフィーにより均一体まで精製されており、酵素活性に影響しないN末端へのヘキサヒスチジンタグ付加によって実現されている。組換えヒトTdTはバキュロウイルス発現系での高発現に成功しており、Trichoplusia ni幼虫からモノクローナル抗体アフィニティカラムを用いて1段階で均一体として精製された。この進展は、TdTの構造特性解析に必要な大量のタンパク質を得るうえで不可欠な役割を果たした。

図2．マウスTdTの構造（Loc’h, J.; et al. 2016）

金属イオンの利用

すべてのDNAポリメラーゼが、ヌクレオチド取り込みに伴うリン酸基転移反応を触媒するために二価金属イオンの存在を必要とすることはよく知られている。この機構では、取り込まれるdNTPのデオキシリボース糖近傍に位置するアスパラギン酸残基が一般塩基として機能し、3′-OHからプロトンを引き抜いて、より反応性の高い求核種を生成する。同様に、末端トランスフェラーゼも他のDNAポリメラーゼと同様、触媒反応に二価金属イオンを必要とする。他の酵素と異なり、TdTはCo²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺など複数の二価カチオンを利用できる点で特異的である。一般に、二価金属イオン存在下におけるプライマーp(dA)n（nは鎖長4～50）をdATPで伸長させる速度は、Mg²⁺> Zn²⁺> Co²⁺> Mn²⁺の順に並ぶ。さらに、各金属イオンはヌクレオチド取り込みの速度論に異なる影響を及ぼす。例えば、Mg²⁺はdATPおよびdGTPの優先的利用を促進する一方、Co²⁺はピリミジンであるdTTPおよびdCTPの触媒的重合効率を向上させる。

TdTの生物医学的応用

多数のエビデンスにより、TdTの活性／発現レベルの変化が、がんの発生・進展および一部の化学反応において重要な役割を果たすことが示されている。B細胞性およびT細胞性の急性リンパ性白血病（ALL）患者の多くは、芽球においてTdT発現がさまざまなレベルで認められ、複数のTdTサブタイプを有する。さらに、TdT活性の高値は不良予後と密接に関連し、最終的に生存期間の短縮につながる。これらの知見は、関連する白血病に対する化学療法薬として使用可能なTdT選択的阻害剤の開発を促進してきた。例えば、ヌクレオシドアナログであるコルジセピン（3'-デオキシアデノシン）は末端トランスフェラーゼ陽性白血病細胞に対して細胞毒性を示し、特にアデノシンデアミナーゼ阻害剤デオキシコホルマイシンとの併用で顕著である。しかし、本アナログは副作用のため広くは使用されていない。近年の研究では、特定のアリールジケトヘキセン酸が、鎖終結因子として作用することなくTdTおよびpolλの触媒活性を阻害し、TdT陽性白血病細胞株（Molt4）に対して強い細胞毒性を示すことが報告されている。

TdTは、合成オリゴヌクレオチドの3'末端を放射性ヌクレオチドまたは各種蛍光プローブで標識するための生体触媒として利用できる。これらの標識プライマーは相補鎖にアニーリングさせた後、制限エンドヌクレアーゼ、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、DNAグリコシラーゼなど、核酸代謝に関与する酵素活性をモニタリングするための放射性基質として使用できる。