トランスフェラーゼ

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ほとんどすべての特性化されたDNAポリメラーゼは、DNAまたはRNAをテンプレートとして使用し、各統合イベントを導くために、特にモノヌクレオチドを成長プライマーに統合する反応を触媒します。しかし、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）と呼ばれるユニークなDNAポリメラーゼは、単鎖DNAのみを基質として使用します。TdTは、ゲノム材料をde novoで生成する独自の能力を持ち、科学者にとって最も魅力的なDNAポリメラーゼの一つとなっています。TdTは哺乳類で非常に早くに同定されましたが、DNA合成を触媒する酵素の中で最も理解されていない酵素の一つです。

図1. TdTの触媒プロセス (Deshpande, S.; et al. 2019)

過去数十年にわたり、この酵素の異なるmRNAスプライシングバリアントが同定され、牛、マウス、および人間で広く研究されてきました。これまでのところ、マウスでは2つのTdTスプライスバリアントが観察されており、牛と人間ではそれぞれ3つ存在します。

マウスでは、TdTの2つの同定されたスプライスバリアントは、TdTS（509アミノ酸からなる短い形式）とTdTL（529残基からなる長い形式）です。TdTSは、抗原受容体遺伝子へのヌクレオチドの偏りのない非テンプレート追加を触媒し、TdTLは3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を持っています。しかし、他の研究者は、TdTLにはエキソヌクレアーゼ酵素活性がないと考えており、TdTSとほぼ同じ酵素活性を示すとしていますin vitro。この調節のメカニズムはまだ明らかではありませんが、これらのデータは、2つのTdTマウスアイソフォームの機能が抗原受容体可変領域の完全性を維持するために抗原レパートリーの多様性をバランスさせることを示しています。ヒト（h）および牛（b）のTdTアイソフォームは、各々がTdTS（短い）、TdTL1（長い）、およびTdTL2（長い）という3つの代替スプライスバリアントを持つため、より複雑です。

TdTの出所と精製

TdTは1971年に子牛の胸腺腺から初めて精製されました。最初は、分離されたタンパク質はプロテオリシスされた形態であると考えられ、αおよびβサブユニットのヘテロダイマーとして元々同定された2つのペプチドを含んでいました。しかし、その後の研究により、TdTは分子量58,000から60,000ダルトンのモノマー型タンパク質であることが確認されました。しかし、容易に加水分解されるため、完全で高活性な酵素を得ることは非常に困難です。急性リンパ芽球性白血病の患者から培養された細胞株から大量のTdTを精製することができますが、この方法は大量生産には高価すぎます。現在、TdTは主にカラムクロマトグラフィーによって均一な形態に精製されており、これはその酵素活性に影響を与えないN末端にヘキサヒスチジンタグを付加することによって達成されます。組換えヒトTdTは、バキュロウイルス発現系で過剰発現され、モノクローナル抗体親和性カラムを使用してTrichoplusia ni幼虫から一段階で均一に精製されることに成功しました。この進展は、TdTの構造特性評価に必要な大量のタンパク質を生成する上で不可欠な役割を果たしました。

図2. マウスTdTの構造 (Loc’h, J.; et al. 2016)

金属の利用

すべてのDNAポリメラーゼがヌクレオチドの取り込みに関連するリン酸転移反応を触媒するために二価金属イオンの存在を必要とすることはよく知られています。このメカニズムでは、到着するdNTPのデオキシリボース糖の近くにあるアスパラギン酸残基が、3′-OHからプロトンを抽出する一般的な塩基として機能し、より反応性の高いヌクレオフィルを生成します。同様に、ターミナルトランスフェラーゼは、すべてのDNAポリメラーゼと同様に、触媒のために二価金属イオンを必要とします。他の酵素とは異なり、TdTはCo²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、およびMg²⁺などの複数の二価カチオンを使用する能力においてユニークです。一般的に、二価金属イオンの存在下で、dATPを用いたプライマーp(dA)n（nは4から50の鎖長）の伸長速度は次の順序で配置されます：Mg²⁺> Zn²⁺> Co²⁺> Mn²⁺。さらに、各金属イオンはヌクレオチド取り込みの動力学に異なる影響を与えます。例えば、Mg²⁺はdATPおよびdGTPの優先的利用を促進し、Co²⁺はピリミジン、dTTP、およびdCTPの触媒重合効率を改善します。

TdTのバイオ医療応用

TdTの活性/発現レベルの変化が癌の発生と進展、ならびにいくつかの化学反応において重要な役割を果たすことを示す大量の証拠があります。ほとんどのB細胞およびT細胞急性リンパ性白血病（ALL）患者は、異なるレベルのTdT発現とその芽球細胞における複数のTdTサブタイプを示します。さらに、TdT活性の高いレベルは、予後不良と密接に関連しており、最終的には生存期間の短縮につながります。これらの発見は、これらの関連する白血病の化学療法薬として使用できるTdT選択的阻害剤の開発を促進しました。例えば、ヌクレオシド類似体であるコルジセピン（3'-デオキシアデノシン）は、特にアデノシンデアミナーゼ阻害剤デオキシコフォルミシンと併用した場合、ターミナルトランスフェラーゼ陽性の白血病細胞に対して細胞毒性を示します。しかし、この類似体は副作用のために広く使用されていません。最近の研究では、特定のアリルジケトヘキセン酸が、鎖終結剤として作用せずにTdTおよびポリλの触媒活性を阻害し、TdT陽性白血病細胞株（Molt4）に対して強い細胞毒性を示すことが報告されています。

TdTは、合成オリゴヌクレオチドの3'末端を放射性ヌクレオチドまたは異なる蛍光プローブでラベル付けするためのバイオカタリストとして使用でき、これらのラベル付けされたプライマーは相補鎖にアニーリングされ、制限内因性ヌクレアーゼ、テンプレート依存DNAポリメラーゼ、DNAグリコシラーゼなどの核酸代謝に関与する酵素の活性を監視するための放射性基質として使用されます。