TEVプロテアーゼ

関連する読書

TEVプロテアーゼは、高い配列特異性を有するシステインプロテアーゼであり、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)を認識し、Gln残基とGly/Ser残基の間を切断します。TEVプロテアーゼは、Tobacco Etch Virus（TEV）プロテアーゼとしても知られ、同様にアミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)を認識してGlnとGly/Serの間を切断する、高い配列特異性を有するシステインプロテアーゼです。マルトース結合タンパク質（MBP）やポリヒスチジンなどのアフィニティ精製タグを、融合タンパク質から除去する目的で広く使用されます。TEVプロテアーゼには、ニッケルアフィニティ樹脂を用いて反応系から容易に除去できるよう7×Hisタグが付加されており、さらに熱安定性の向上および自己分解（オートリシス）の低減を目的として改変されています。

構造

現在、X線結晶構造解析によりTEVプロテアーゼの構造が解明されています。本酵素は2つのβバレルと柔軟なC末端テールから構成され、キモトリプシンスーパーファミリーのプロテアーゼ（MEROPS分類：PAファミリー、C4ファミリー）と構造相同性を有します。TEVプロテアーゼは、トリプシン、エラスターゼ、トロンビン等の細胞性セリンプロテアーゼと相同性を示す一方で、触媒求核剤としてシステインを用います（多くのウイルスプロテアーゼと同様）。共有結合触媒は、2つのバレルに分かれて配置されたAsp-His-Cysの三残基（Aspはβ1、HisおよびCysはβ2）により担われます。マトリクスはβシート構造として保持され、バレル間の裂溝とは逆平行相互作用を、C末端テール末端とは平行相互作用を形成します。その結果、酵素は基質の周囲に結合チャネルを形成し、側鎖相互作用が特異性を制御します。

図1. TEVプロテアーゼの構造。

TEVプロテアーゼの由来

Tobacco etch virusは、その全ゲノムを単一の大型ポリプロテイン（350 kDa）としてコードしています。これは3種類のプロテアーゼ、すなわちP1プロテアーゼ（切断部位1か所）、補助成分プロテアーゼ（切断部位1か所）、およびTEVプロテアーゼ（切断部位7か所）によって機能単位へと切断されます。天然のTEVプロテアーゼには内部自己切断部位も含まれます。この部位が緩徐に切断されると酵素は不活化します（生理学的意義は不明）。

用途

本タンパク質の主要な用途の一つは、精製した組換え融合タンパク質からアフィニティタグを除去することです。TEVプロテアーゼが生化学的ツールとして用いられる理由は、その高い配列特異性にあります。認識配列を柔軟なループ領域に挿入することで、この特異性によりタンパク質の制御された切断が可能となります。タンパク質中に認識配列がほとんど存在しないため、生体内でも比較的毒性が低いとされています。合理的設計によるプロテアーゼ特異性の改変は限定的な成功にとどまっていますが、指向性進化により切断部位の前後における好適残基を変更する試みが行われています。一方で、TEVプロテアーゼには生化学的ツールとしての制約もあります。内部切断部位における単一のS219V変異により回避可能であるものの、自己切断（オートリシス）により容易に不活化されます。単独発現したプロテアーゼは不溶性であることも知られており、指向性進化や計算機設計により溶解性を改善する試みがなされています。また、溶解性向上パートナーとして機能するマルトース結合タンパク質（MBP）との融合により、発現性が改善されることも示されています。酵素の分子量は、使用するコンストラクトにより25～27 kDaの範囲で変動します。