TEVプロテアーゼ

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TEVプロテアーゼは、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)を認識し、GlnとGly/Ser残基の間で切断する非常に特異的なシステインプロテアーゼです。TEVプロテアーゼはタバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼとも呼ばれ、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)を認識し、GlnとGly/Ser残基の間で切断します。これは、融合タンパク質からマルトース結合タンパク質（MBP）やポリヒスチジンなどのアフィニティ精製タグを除去するためによく使用されます。TEVプロテアーゼは、ニッケルアフィニティ樹脂を使用した反応からの容易な除去のために7xHisタグを持ち、熱安定性を向上させ、自動分解を減少させるように設計されています。

構造

現在、X線結晶構造解析によりTEVプロテアーゼの構造が解明されています。これは2つのβバレルと柔軟なC末端テールから構成され、プロテアーゼのキモトリプシンスーパー家族（PAファミリー、MEROPSによって分類されたC4ファミリー）との構造的相同性があります。TEVプロテアーゼは細胞性セリンプロテアーゼ（トリプシン、エラスターゼ、トロンビンなど）に相同ですが、触媒ヌクレオフィルとしてシステインを使用します（他の多くのウイルスプロテアーゼと同様）。共有結合触媒作用は、2つのバレルの間に分離されたAsp-His-Cysトリプレットによって行われます（β1上のAspとβ2上のHisおよびCys）。マトリックスはベータシートの形状を保ち、バレル間の亀裂との逆平行相互作用を形成し、C末端のテールエンドとの平行相互作用を形成します。したがって、酵素は基質の周りに結合チャネルを形成し、側鎖相互作用が特異性を制御します。

図1. TEVプロテアーゼの構造。

TEVプロテアーゼの供給源

タバコエッチウイルスは、その全ゲノムを単一の大きな多タンパク質（350 kDa）としてコードしています。これは、3つのプロテアーゼによって機能単位に切断されます：P1プロテアーゼ（1つの切断部位）、補助成分プロテアーゼ（1つの切断部位）、およびTEVプロテアーゼ（7つの切断部位）。自然のTEVプロテアーゼは内部自己切断部位も含んでいます。この部位をゆっくり切断すると、酵素が不活性化されます（生理的理由は明確ではありません）。

応用

このタンパク質の主な目的の1つは、精製された再組換え融合タンパク質からアフィニティタグを除去することです。TEVプロテアーゼを生化学的ツールとして使用する理由は、その高い配列特異性です。優先配列が柔軟なループに挿入されると、この特異性によりタンパク質の制御された切断が可能になります。タンパク質内には認識される配列がほとんどないため、体内で比較的非毒性になります。合理的設計はプロテアーゼの特異性を変更するのに限られた成功を収めていますが、指向進化が切断部位の前後の好ましい残基を変更するために使用されています。しかし、TEVプロテアーゼは生化学的ツールとしての限界もあります。自己切断（自動分解）によって容易に不活性化されますが、内部切断部位での単一のS219V変異によって排除できます。単独で発現したプロテアーゼも不溶性ですが、指向進化や計算設計を通じてその溶解性を改善する試みがなされています。また、マルトース結合タンパク質（MBP）との融合によって発現が改善されることが示されており、これは溶解性を高めるパートナーとして機能します。酵素の分子量は、使用される特定の構造体によって25から27 kDaの間で変動します。