プロテイナーゼK

プロテイナーゼKは、サブチリシンファミリー（S8）に属する代表的なプロテアーゼです。アミノ酸配列はエドマン分解および遺伝子配列解析により決定されています。本酵素は278アミノ酸残基からなるポリペプチド鎖で、分子量28,930、等電点（pI）8.9を示します。プロテイナーゼKはエンドペプチダーゼであり、活性部位にAsp39、His69、Ser224からなる触媒三残基を有します。酵素活性の完全発現にはカルシウムイオンの存在が必要です。最大活性はpH 7.5～12.0の範囲で認められます。Tris-HCl緩衝液（pH 9.3）中、30°Cにおいて、1分間にAc-Tyr-OEtを1μmol加水分解する活性を1ユニットとした場合、比活性は約300 U/mgです。ペプチジルクロロメタンおよびHg2+は阻害剤として作用し、Hg2+は過剰存在下でも7%の活性が残存します。プロテイナーゼKは低濃度（約0.01 mg/mL）でも溶解しますが、1.0 mg/mL以上の濃度でより安定です。

図1. プロテイナーゼKの構造。

阻害剤

プロテイナーゼKはセリンプロテアーゼであるため、セリンプロテアーゼ阻害剤であるベンジルスルホニルフルオリドにより阻害されます。

図2. ベンジルスルホニルフルオリドの化学構造。

機能

特筆すべき点として、プロテイナーゼKはin situハイブリダイゼーション（ISH）技術におけるプレハイブリダイゼーション処理で一般的に使用されます。標的DNAに結合するタンパク質を消化・除去することで、プローブが標的核酸へ結合する機会を増加させ、ハイブリダイゼーションシグナルを改善します。一方で、プロテイナーゼKの濃度が高すぎる、消化時間が長すぎる、またはインキュベーション温度が高すぎる場合、細胞構造が一定程度損傷し、組織切片の剥離や核の消失を引き起こして、ハイブリダイゼーション結果に影響を及ぼす可能性があります。EDTA緩衝液はプロテイナーゼKの役割を代替し得ます。上記の問題を解決し、理想的な染色効果を得ることができます。

特長

プロテイナーゼKは広範な切断活性を有するセリンプロテアーゼです。脂肪族および芳香族アミノ酸のカルボキシ末端側のペプチド結合を切断します。本酵素はRNaseおよびDNase活性を除去するよう精製されています。プロテイナーゼKは尿素およびSDS中で安定であり、天然タンパク質を分解する能力を有するため、パルスフィールド電気泳動用の染色体DNA調製、ウェスタンブロッティング、ならびにDNA/RNA調製におけるヌクレアーゼ除去など、幅広く使用されています。一般的な作業濃度は50～100 μg/mLです。広いpH範囲（pH 4～12.5）で活性を示します。

推奨反応緩衝液：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM CaCl₂。

プロテイナーゼK調製標準（20 mg/mL）：プロテイナーゼK 200 mgを水9.5 mLに加え、プロテイナーゼKが完全に溶解するまで穏やかに混和します。ボルテックスによる攪拌は行わないでください。水を加えて全量10 mLに調整し、その後分注して-20°Cで保存します。

プロテイナーゼKの保存：-20°Cで冷凍保存し、凍結融解の反復を避けてください。有効期間は12か月です。

インキュベーション温度は55～65°C、最適インキュベーション温度は58°Cです。インキュベーション時間は15分～48時間で、最適インキュベーション時間は2時間です。

用途

プロテイナーゼKは、皮革、毛皮、絹、医薬、食品、醸造などの分野で広く利用されています。皮革産業における脱毛および軟化工程ではプロテアーゼが広く用いられ、時間短縮と作業衛生の改善に寄与しています。プロテアーゼは、絹の精練（脱膠）、食肉の軟化、ワインの清澄化にも使用可能です。臨床用途としては、消化不良に対するペプシン、気管支炎に対する酸性プロテアーゼ、血管炎に対するエラスターゼ、ならびに外科的化膿創の浄化におけるトリプシンおよびキモトリプシンの使用、胸腔内漿膜癒着の治療などが挙げられます。酵素配合洗剤は洗剤分野の新製品であり、アルカリ性プロテアーゼを含有し、衣類上の血液汚れやタンパク質汚れを除去できます。ただし、使用時に皮膚へ接触しないよう注意してください。皮膚表面のタンパク質を損傷し、発疹や湿疹などのアレルギーを引き起こすおそれがあります。

参考文献