プロテイナーゼ K

プロテイナーゼKは、サブチリシンファミリーのプロテアーゼ（S8）の典型的なメンバーです。アミノ酸配列はエドマン分解と遺伝子配列によって得られます。ポリペプチド鎖は278のアミノ酸からなり、分子量は28,930、等電点は8.9です。プロテイナーゼKはエンドペプチダーゼであり、活性部位には触媒三重体Asp39、His69、Ser224を持っています。完全な酵素活性にはカルシウムイオンの存在が必要です。最大活性はpH 7.5-12.0の範囲にあります。1ユニットがpH 9.3、30°CのTris-HClバッファー中で1μmolのAc-Tyr-OEtを1分間に加水分解すると、特異活性は約300 Umg21です。ペプチジルクロロメタンとHg21は阻害剤として作用し、過剰な場合でも7%のHg21が活性を保ちます。プロテイナーゼKは低濃度（約0.01mg/ml）で溶解しますが、1.0mg/ml以上の濃度ではより安定です。

図1. プロテイナーゼKの構造。

阻害剤

プロテイナーゼKはセリンプロテアーゼであるため、セリンプロテアーゼの阻害剤であるベンジルスルホニルフルオリドでその効果を阻害できます。

図2. ベンジルスルホニルフルオリドの化学構造。

機能

プロテイナーゼKは通常、in situハイブリダイゼーション技術における前ハイブリダイゼーション処理に使用されることに注意する価値があります。これは、ターゲットDNAタンパク質を消化し、周囲を取り囲む効果があり、プローブがターゲット核酸に結合する機会を増やし、ハイブリダイゼーション信号を改善します。しかし、プロテイナーゼKの濃度が高すぎる場合、消化時間が長すぎる場合、またはインキュベーション温度が高すぎる場合、細胞の構造がある程度損なわれ、組織切片の剥離や核の消失が生じ、ハイブリダイゼーションの結果に影響を与えます。EDTAバッファーはプロテイナーゼKの役割を代替できます。上記の問題を解決し、理想的な染色効果を達成します。

特徴

プロテイナーゼKは、広範な切断活性を持つセリンプロテアーゼです。これは、脂肪族および芳香族アミノ酸のカルボキシ末端ペプチド結合を切断します。この酵素は、RNaseおよびDNase活性を除去するために精製されています。プロテイナーゼKは尿素およびSDSに安定しており、天然タンパク質を分解する能力があるため、パルス電気泳動、ウエスタンブロッティング、DNAおよびRNA調製におけるヌクレアーゼの除去を含む広範な用途で使用されています。プロテイナーゼKの一般的な作業濃度は50-100 μg/mlです。pH 4-12.5の広範なpH範囲で活性を持ちます。

推奨反応バッファー：50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM CaCl₂。

プロテイナーゼK調製標準：20mg/mlのプロテイナーゼK調製標準：200mgのプロテイナーゼKを9.5mlの水に加え、プロテイナーゼKが完全に溶解するまで優しく振とうします。混合するためにボルテックスしないでください。水を加えて10mlにし、分注して-20°Cで保存します。

プロテイナーゼKの保存：-20°Cの冷蔵庫で保存し、繰り返しの凍結-解凍サイクルを避け、12ヶ月の有効性を効果的に保証します。

インキュベーション温度は55〜65°Cで、理想的なインキュベーション温度は58°C、インキュベーション時間は15分から48時間です。理想的なインキュベーション時間は2時間です。

応用

プロテイナーゼKは、皮革、毛皮、絹、医療、食品、醸造に広く使用されています。皮革産業では、毛の除去と柔軟化にプロテアーゼが広く利用され、時間を節約し、労働衛生を改善しています。プロテアーゼは、絹の脱ゴム化、肉の柔らかさ向上、ワインの澄明化にも使用できます。臨床的には、消化不良の治療にペプシン、酸性プロテアーゼによる気管支炎、エラスターゼによる血管炎、トリプシンおよびキモトリプシンによる外科的膿瘍の浄化、胸腔漿膜の癒着の治療に使用されます。酵素を含む洗濯粉は、洗剤の新製品です。アルカリ性プロテアーゼを含み、衣服の血液汚れやタンパク質の汚れを除去できます。ただし、使用時には皮膚に接触しないように注意し、皮膚表面のタンパク質を損傷し、発疹や湿疹などのアレルギーを引き起こさないようにしてください。

参考文献