パッド

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はじめに

ヒストンは真核生物のDNAの足場として機能するクロマチンの基本的な構成要素です。ヒストン構造の変化は、DNA（または他の核タンパク質）との相互作用に直接影響を与え、全体的なクロマチン機能を変化させます。ヒストンはメチル化、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、シトルリン化など、高度に翻訳後修飾（PTM）されています。その中でも、シトルリン化（脱イミン化とも呼ばれる）は、ペプチジルアルギニンがペプチジルシトルリンに加水分解されるプロセスです。このプロセスは、タンパク質アルギニン脱イミナーゼ（PAD）ファミリーの酵素によって触媒されます。PADの過剰発現と酵素活性の上昇は、リウマチ性関節炎（RA）、アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病、多発性硬化症（MS）、癌など、多くの疾患で観察されています。など。

ヒトにおいて、PADファミリーは5つのカルシウム依存性アイソザイム（PADs 1-4および6）から構成され、約50％の配列類似性を共有しています。PADは、表皮や子宮（PAD1）、骨格筋、脳、炎症細胞、分泌腺（PAD2）、毛包や角化細胞（PAD3）、好中球やいくつかの種類の癌（PAD4）、および卵母細胞や胚（PAD6）など、多くの細胞や組織で発現しています。PAD4はヒストンの脱イミン化に関与することが示されている唯一のアイソザイムですが、最近の報告ではPAD2もヒストンを脱イミン化する可能性があることが示されています。最近の研究では、PADは細胞質や核に加えて、PAD4やPAD2のように顆粒やミトコンドリアにも存在する可能性があることが示されています。

現在、フィブリノーゲン、アクチン、フィラグリンもPADの基質であるという証拠があり、これらのタンパク質のシトルリン化はリウマチ性関節炎で発生することが知られています。

図 1. PADsはペプチジルアルギニンをペプチジルシトルリンに加水分解する触媒です (Bicker, K.L.; Thompson, P.R. 2014)

PADの構造とメカニズム

PAD4のカルシウムの有無や基質結合に関する構造を明らかにするために多くの研究が行われてきました。研究により、PAD4は合計5つのカルシウム結合部位を含み、そのうちの2つはN末端とC末端ドメインを橋渡しするのに役立ち、残りの3つのカルシウム結合部位はN末端ドメインに位置しています。これらの3つの結合部位はさらに2つの免疫グロブリン様サブドメインに分けることができ、そのうちの1つには核局在信号（NLS）が含まれています。興味深いことに、N末端ドメインの残基158-171はカルシウムフリーの形では非常に無秩序ですが、カルシウムの存在下では非常に秩序のあるαヘリックスを形成します。科学者たちは、この立体構造の変化がタンパク質と酵素の相互作用を調節することを推測しています。C末端ドメインでは、カルシウム結合が立体構造の変化を引き起こし、それが活性部位の切れ目を作り出します。

現在、PADの触媒メカニズムに関する多くの研究が行われています。これらの研究は、PADが逆プロトン化メカニズムを使用していることを明らかにしました。このメカニズムでは、PAD4の活性部位のヌクレオフィルであるCys645は、酵素の活性型でチオレートとして存在します。活性部位のもう1つの重要な残基であるHis471は、基質のグアニジン基からのアンモニアの初期放出を促進し、その後、水分子を活性化して基質の加水分解を完了させます。PAD 1および3に関する研究でも、これらも同様の逆プロトン化メカニズムを経ることが確認されています。

図 2. ハロアセタミジンベースの阻害剤によるPADの不活化の提案メカニズム (Bicker, K.L.; Thompson, P.R. 2014)

新しいPAD阻害剤の開発

いくつかの可逆的PAD阻害剤が特定されています（例えば、タキソール、ストレプトマイシン、ミノサイクリン）が、これらの化合物は比較的弱いPAD阻害剤であり、これまでに記載された最も効果的な阻害剤は酵素を不可逆的に修飾します。可逆的阻害剤の効果がないのは、酵素がカルシウムに結合する際にアルギニン残基の側鎖しか収容できない小さな活性部位の空洞に関連している可能性があります。可逆的阻害剤の効果がないため、科学者たちは、改善された効力、選択性、および生物利用能を持つCl-アミジン類の開発に努力を集中させています。また、ライブラリーアプローチを使用していくつかの新しいPAD阻害剤も特定されています。例えば、264化合物の比較的小さなライブラリーが固相で合成され、その後PAD阻害剤を特定するためにスクリーニングされました。この方法では、三ペプチド（Thr-Asp-F-アミジン; TDFA）が非常に選択的（最大65倍）なPAD4阻害剤として特定され、優れたin vivo効力を示しました。

図 3. 最も有用なPAD阻害剤の構造、効力、および選択性 (Bicker, K.L.; Thompson, P.R. 2014)