オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ

関連する読書

分類

オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、細胞質型と細胞膜型の2種類に分類される。前者はナトリウムイオン輸送との共役機能を有さず、Microcococcus lysodeikticusにおいて最初に同定された。

図1．オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの構造。

クエン酸発酵経路におけるオキサロ酢酸デカルボキシラーゼの役割

クエン酸はナトリウムイオンの排出と共役して細菌内に取り込まれ、クエン酸リアーゼによりオキサロ酢酸および酢酸に分解される。オキサロ酢酸は細胞膜上のオキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより脱炭酸されてピルビン酸を生成し、この脱炭酸反応は2個のナトリウムイオンを細胞外へ排出する輸送と共役している。ピルビン酸はさらにアセチル補酵素Aおよびギ酸へ分解され、その後、アセチル補酵素Aからアセチルリン酸が生成される。本反応経路においては、とりわけ生合成反応におけるNADH合成が重要である。

オキサロ酢酸デカルボキシラーゼのサブユニット

オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、α、βおよびλの3種類の異なるサブユニットからなり、1:1:1の比率で構成される。図1に示すとおり、周辺部に位置するαサブユニット（63.5 kU）は、N末端側のカルボキシルトランスフェラーゼドメインとC末端側のビオチン結合ドメインという2つの明確に異なる構造ドメインを含む。プロリンおよびアラニンに富むペプチド鎖が、これら2つの構造ドメイン間でビオチン置換部位を連結している。ペプチド鎖のC末端から35アミノ酸残基の位置において、ビオチンはリジン残基に共有結合している。オキサロ酢酸デカルボキシラーゼのβサブユニット（44.9 kU）は強い疎水性を示し、細胞膜に強固に結合している。

サブユニットの機能

オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの触媒サイクルは、オキサロ酢酸がαサブユニットのカルボキシルトランスフェラーゼドメインに結合することから開始し、続いてオキサロ酢酸のカルボキシル基がビオチンへ転移される。カルボキシル化ビオチンは、可動性の高いプロリン‐アラニン鎖による置換を介して、αサブユニットのカルボキシルトランスフェラーゼ部位からβサブユニットのデカルボキシラーゼ部位へ移動する。カルボキシビオチンの脱炭酸の過程では、膜外から取り込まれたプロトンが消費される一方で、2個のナトリウムイオンがペリプラズム空間へ汲み出される。この一連の生化学反応は、当該タンパク質のコンフォメーション変化と密接に関連している。例えば、2つの触媒構造ドメイン間におけるビオチン成分の置換がナトリウムチャネルの開閉に関与している可能性があり、これらのコンフォメーション変化は生化学反応と空間的・時間的に協調して進行し、全体の脱炭酸反応にとって重要である。

精製

オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、2段階の抽出プロセスにより単離・精製できる。すなわち、界面活性剤を用いて膜からタンパク質を可溶化した後、対応する抗生物質結合タンパク質を固定化したアガロースカラムによるアフィニティークロマトグラフィーを行う。Klebsiella pneumoniae由来オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの3サブユニット複合体は、誘導発現によりE. coli内での合成に成功しており、変異導入による解析を容易にした。さらに、2サブユニット複合体であるα_γおよびβ_γについても、実験においてクローニング、発現および単離が行われている。

膜βサブユニットのトポロジー異性解析

膜タンパク質のトポロジー解析は、膜貫通断片の数および配向、ならびに膜貫通タンパク質のC末端およびN末端の局在を記述する。オキサロ酢酸デカルボキシラーゼのβサブユニットは433アミノ酸残基からなる疎水性タンパク質であり、疎水性解析から9～10個の膜貫通構造を有することが示されている。推定膜貫通領域において複数の部位を選択し、標的タンパク質のペプチド鎖を中断してアルカリホスファターゼまたはβ-ガラクトシダーゼとの融合タンパク質を作製し、融合部位の局在を調べることで、タンパク質全体の膜貫通トポロジーを解析した。