オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ

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分類

オキサロ酢酸脱炭酸酵素は、細胞質型と細胞膜型の2種類に分けられます。前者はナトリウムイオン輸送機能を持たず、最初にMicrocococcus lysodeikticusで同定されました。

図1. オキサロ酢酸脱炭酸酵素の構造。

クエン酸発酵経路におけるオキサロ酢酸脱炭酸酵素の役割

クエン酸は、ナトリウムイオンの輸出と結合して細菌に取り込まれ、クエン酸リラーゼによってオキサロ酢酸と酢酸に分解されます。オキサロ酢酸は、細胞膜上のオキサロ酢酸脱炭酸酵素によって脱炭酸されてピルビン酸を生成し、脱炭酸反応は細胞外への輸出のために2つのナトリウムイオンを結合させます。ピルビン酸はさらにアセチルコエンザイムAと蟻酸に分解され、その後アセチルコエンザイムAがアセチルリン酸を形成する反応が続きます。この反応経路では、特に生合成反応であるNADH合成が重要です。

オキサロ酢酸脱炭酸酵素のサブユニット

オキサロ酢酸脱炭酸酵素は、3つの異なるサブユニットα、β、λから1:1:1の比率で構成されています。図1に示すように、周辺のαサブユニット（63.5 ku）は、N末端のカルボキシルトランスフェラーゼドメインとC末端のビオチン結合ドメインの2つの異なる構造ドメインを含んでいます。プロリンとアラニンが豊富なペプチド鎖が、これら2つの構造ドメイン間のビオチン置換をつなげています。ペプチド鎖のC末端から35アミノ酸残基の位置に、ビオチンがリジン残基に共有結合しています。オキサロ酢酸脱炭酸酵素のβサブユニット（44.9 ku）は、非常に疎水性が強く、細胞膜にしっかりと結合しています。

サブユニットの機能

オキサロ酢酸脱炭酸酵素の触媒サイクルは、オキサロ酢酸がαサブユニットのカルボキシルトランスフェラーゼドメインに結合することから始まり、その後オキサロ酢酸のカルボキシル基がビオチンに転送されます。カルボキシル化されたビオチンは、柔軟なプロリンアラニン鎖の置換後、αサブユニットのカルボキシルトランスフェラーゼ部位からβサブユニットの脱炭酸酵素部位に移動します。カルボキシビオチンの脱炭酸中に、膜外から取り込まれたプロトンが消費され、2つのナトリウムイオンがペリプラズミックスペースにポンプされます。この一連の生化学反応は、そのタンパク質の立体構造変化と密接に関連しています。例えば、2つの触媒構造ドメイン間のビオチン成分の置換は、ナトリウムチャネルの開閉に関与している可能性があり、これらの立体構造変化は生化学反応と空間的および時間的に調整されており、全体の脱炭酸反応にとって重要です。

精製

オキサロ酢酸脱炭酸酵素は、膜からタンパク質を溶解するために界面活性剤を使用し、その後対応する抗生物質タンパク質を用いたアガロースカラムでのアフィニティクロマトグラフィーを行うことで、2段階の抽出プロセスで分離および精製できます。Klebsiella pneumoniaeのオキサロ酢酸脱炭酸酵素の3サブユニット複合体は、誘導発現によってE. coliで成功裏に合成され、突然変異導入による研究が促進され、2サブユニット複合体α_γおよびβ_γも実験でクローニング、発現、分離されました。

膜βサブユニットのトポロジー異性体分析

膜タンパク質のトポロジー分析は、膜貫通断片の数と向き、および膜貫通タンパク質のC末端とN末端の分布を説明します。オキサロ酢酸脱炭酸酵素のβサブユニットは、433アミノ酸残基からなる疎水性タンパク質であり、疎水性分析により9から10の膜貫通構造を持つことが示されています。推定される膜貫通領域では、ターゲットタンパク質のペプチド鎖を中断するために複数の部位が選択され、アルカリフォスファターゼまたはβ-ガラクトシダーゼとの融合タンパク質を形成し、融合部位の位置を調べることで膜を越えて全体のタンパク質が分析されました。