ニトロ還元酵素

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序論

酵素スーパーファミリーは相同酵素から構成され、特定の選択的な活性部位特性および一定の触媒機構上の特徴を共有する一方で、多様な機能を示す。スーパーファミリー内における機能差を理解することは、基礎生物学における重要課題である。酵素機能は、それが関与する代謝経路の適応要件により駆動され、段階的に進化するのだろうか。酵素スーパーファミリーの機能分化機構を解明することは極めて困難である。なぜなら、この過程は約数十億年に及ぶ進化史の中で生じたためである。

酵素スーパーファミリーは通常、多数の異なる機能ファミリーから構成される。機能ファミリー間の配列は大きく異なり、ペアワイズ配列同一性が10%未満となる場合もあるうえ、既存の配列情報は広範に分散している。さらに、スーパーファミリーに属する酵素の大半は未同定（機能未注釈）のままである。スーパーファミリーには通常2万を超える配列が含まれ、このように多様性の高い大規模データセットを解析するには、より高度な技術が必要となる。

その後、バイオインフォマティクス解析により、研究者らはフラビンモノヌクレオチド（FMN）依存性ニトロレダクターゼ（NTR）スーパーファミリーにおける多様性の問題を解決した。NTRスーパーファミリーは進化年代が約25億年と推定される古いスーパーファミリーであり、2万を超える配列を含む。本ファミリーは、数十年前に最初に特徴付けられたニトロ基還元反応に由来して命名された。しかし、ニトロ還元に加えて、NTRスーパーファミリーは脱水素、脱ハロゲン化、フラビン開裂など、さまざまな反応も触媒し得る。

NTRはα+βフォールドを形成し、主としてフラビンを非共有結合的に結合する。NTRは通常、2つのモノマーサブユニットからなるホモ二量体である。二量体界面において2つのFMN結合性活性部位が形成され、活性部位の形成には両モノマーが重要である（図1A）。他のフラビン結合タンパク質と比較して、NTRスーパーファミリーでは二量体化がFMN結合および酵素機能に必須である。NTRは一般に、ニコチンアミド補因子を用いて結合FMNへ電子を供与し、その後、還元半反応において下流の電子受容体へ電子を移動させる、ピンポン型Bi-Bi酸化還元反応機構を採用する（図1BおよびC）。

図1. NTRスーパーファミリーの構造および反応多様性の概観（Akiva, E.; et al. 2017）

NTRスーパーファミリーにおける配列多様性の全体像

NTRスーパーファミリー内の配列多様性を検討するため、研究者らは公開データベースから、本スーパーファミリーに関連する利用可能な全配列および構造のうち、非冗長なセットを収集した。本データセットには、長さ150〜1,580アミノ酸（aa）の非冗長NTR配列24,270件が含まれる。これら全配列間の類似性は「all-vs.-all」BLASTにより算出し、SSNを用いて結果情報を可視化した。

図2のSSNでは、ノード（円）がペアワイズ配列同一性>60%を共有する配列セットを表す。この類似性レベルにより、単一の代表ノード内の配列は統計学的に有意にアラインメント可能となり、スーパーファミリー全体の可視化が可能となる。しかし、同一性60%という閾値は、異なる機能を有する酵素を単一の代表ノードに集約してしまう可能性もある。

図2. NTRスーパーファミリーの代表的SSN（Akiva, E.; et al. 2017）

NTRスーパーファミリーの機能多様性は依然として不明である

これまでの多くの研究は、スーパーファミリーの限られた少数メンバーを対象とした詳細な生化学的・構造的特性解析に焦点を当ててきた。しかし、包括的なバイオインフォマティクス解析により、NTRスーパーファミリーに属する酵素の最大99%が実験的に特徴付けられていないことが示されている。さらに、機能および／または構造情報を有する配列の割合は、サブグループ間で不均一である。例えば、SagBサブグループでは特徴付けられた配列が少ない。このサブグループは大規模かつ多様で（平均配列同一性は32%未満）、基質特異性および触媒特異性の異なる、より小さな「サブサブグループ（SSG）」を含む可能性がある。同様に、NfsAおよびNfsBサブグループでも平均配列同一性40%未満が観察される。現時点で特徴付けられているのは、NfsBサブグループ2,632配列中18配列、NfsAサブグループ2,299配列中20配列であり、総数のおよそ1%に相当する。