Nhase

酵素学において、微生物によるニトリル同化に関与するニトリルヒドラターゼ（NHase；EC 4.2.1.84）は、関与する金属に基づき概ね2群に分類される。すなわち、単核鉄酵素および非コリノイド型コバルト酵素であり、これらは多様なニトリルを対応するアミドへ水和し、生成したアミドはさらにアミダーゼによりカルボン酸へ変換される。NHaseは温和な条件下でニトリルを高付加価値の対応アミドへ変換できることから、有機化学プロセスにおける触媒として大きな可能性を有し、極めて高速に非常に高濃度のアミドを蓄積し得ることから、最も重要な工業用酵素の一つとなっている。水和酵素であるNHaseと加水分解酵素であるアミダーゼは、細菌におけるニトリルの逐次代謝を担い、ニトリルを窒素源および炭素源として単独で利用可能な細菌において機能する。また両者は協働して、一次アミド中間体を形成せずにニトリルを加水分解するニトリラーゼの代替経路としても機能し得る。

由来

多数のNHaseが幅広い微生物において検出されている。既知の中温性NHase産生微生物の多くはRhodococcus属が占めており、これまでに報告された好熱性NHase産生生物は5種にとどまる。各種NHaseサブグループは、起源、安定性、補因子要件、触媒特性において顕著な差異を示す一方、サイズおよびタンパク質配列の観点では高い相同性が認められる。襟鞭毛虫Monosiga brevicollisのゲノム配列にはNHaseをコードし得る配列が存在し、同生物の当該遺伝子はαおよびβサブユニットが単一遺伝子として融合した構成であった。αおよびβサブユニットの融合からなる同様のNHase遺伝子は複数の真核生物スーパーグループでも同定されており、この種のNHaseが全真核生物の最終共通祖先に存在していた可能性が示唆される。

分子構造

NHaseは、アミノ酸配列上の相同性を持たないαおよびβサブユニットから構成され、αβ二量体またはα₂β₂四量体として存在し、αβユニット当たり1原子の金属を結合する。多数のNHaseの三次元構造解析により、αサブユニットは2本のαヘリックスを含む長く伸長したN末端アームと、特異な4層構造を有するC末端ドメインからなることが示されている。βサブユニットは、αサブユニットを取り巻く長いN末端ループ、αサブユニットのN末端ドメインと密にパッキングするヘリカルドメイン、ならびにβロールと短いヘリックス1本を有するC末端ドメインから構成される。NHaseはαβ型およびα₂β₂型の双方で存在し、さらにin vitroの質量分析実験により、αおよびβサブユニットがまずαβ二量体を形成し、その後に相互作用して四量体を形成し得ることが示されている。

金属補因子

生化学においてコバルトは一般にコリン環内に存在するが、NHaseはコバルトを非コリノイド型で利用する稀な酵素の一つである。細胞膜を介してコバルトを輸送するコバルト透過酵素（permease）が同定されているものの、毒性を惹起することなくコバルトがNHaseへ輸送される機構は依然として不明である。アミノ酸配列VCTLCの存在はCo中心型NHaseを示唆し、VCSLCの存在はFe中心型NHaseを示す。NHase活性部位における金属種は、金属結合部位近傍のαサブユニット配列データを解析することで予測可能である。

反応機構

金属中心は2つのサブユニット界面に位置する中央キャビティ内に存在し、金属原子に対するタンパク質配位子はすべてαサブユニットにより供与される。2つのカルボキサミド窒素、1つのシステイン硫黄、ならびにシステイン-スルフェン酸（Cys-SO）およびシステイン-スルフィン酸（Cys-SO₂）部分に由来する2つの硫黄が、それぞれNHaseの金属中心周囲の配位環境（ドナー配置）を構成する。金属イオンは八面体配位をとり、タンパク質配位子が八面体の5頂点を占める。第6配位座は、NOまたは溶媒交換可能な配位子（水酸化物または水）により占有される。鉄（III）中心の第6配位座におけるNO結合は酵素活性を調節し得る一方、金属結合水酸化物がニトリルの水和に寄与する可能性も示唆されている。金属に配位する2つのCys残基は翻訳後修飾によりCys-スルフィン酸（Cys-SO₂）およびCys-スルフェン酸（Cys-SO）へ変換される。量子化学的研究から、Cys-SO残基は求核性水分子を活性化する塩基として、あるいは求核剤として機能し得ることが予測されている。鉄（III）およびコバルト（III）錯体に関する構造学的・分光学的研究により、金属（III）部位の特異な配位構造がその電位を上昇させ、酸化還元活性を抑制し、第6配位座へのNO結合および結合Sドナーの酸化的修飾を可能にし、さらに金属結合水のpKaを7付近へ近づけることが示されている。

産業応用

NHaseは、アクリロニトリルからアクリルアミドを年産60万トン規模で製造する工業プロセスにおいて長年にわたり効率的に利用されており、これは化学汎用品（コモディティ化学品）製造のための生体変換プロセスとして最初の成功例である。NHaseはまた、廃水からのニトリル除去にも利用されている。鉄中心に一酸化窒素（NO）を結合したNHaseは本質的に光感受性を有し、光解離により活性化され得る。ニコチンアミドは、Rhodococcus rhodochrous J1由来ニトリルヒドラターゼの触媒下で3-シアノピリジンを加水分解することにより工業的に製造されており、同時に飼料用途向けとして年産3,500トンのニコチンアミドが生産されている。

参考文献