LiP

リグニンは複雑かつ安定な生体高分子物質の一種であり、その産生量はセルロースに次いで多い。リグニンペルオキシダーゼ（LiP）はリグニンの生分解過程における主要酵素であり、リグニンポリマー内にフリーラジカルを生成して結合の安定性を低下させ、リグニン高分子を破壊する。LiPはわらおよび飼料作物中のリグニンを加水分解し、飼料原料の品質を改善することで栄養価の向上に寄与する。

特性および由来

1983年、Phanerochaete chrysosporium の制限培地において、初めてLiPが見出された。LiPは酸化還元酵素と考えられており、当該真菌が分泌するヘム含有の糖鎖修飾型細胞外タンパク質ペルオキシダーゼである。研究により、LiPの糖鎖修飾ヘムタンパク質は通常、複数の複合形態、すなわち多様なアイソザイムを含む形で産生されることが示されている。LiPの分子量は一般に37～47 kDaである。精製LiPの分子量は約40 kDa、等電点は約3.5、至適温度は35～55℃、至適pHは2～5である。LiPの酸化還元電位は1.5 Vである。LiPはH₂O₂存在下で芳香環多量体を酸化・分解し得ることから、リグニン分解の鍵酵素の一つと考えられている。

LiPは主として微生物の分泌により産生され、Phanerochaete chrysosporium、Coriolus versicolor、Trametes versicolor、Pleurotus ostreatus、Dioscorea opposita などが挙げられる。1989年には、グラム陽性菌T7AもLiPを産生できることが見出された。

構造

LiPは約343残基のアミノ酸からなり、4本のジスルフィド結合を有する。LiPは折りたたまれて約50 × 40 × 40 Åの球状構造を形成する。ヘムはタンパク質内に完全に固定されているが、2つの小さなチャネルを介してアクセス可能であり、ヘムにより近位ドメインと遠位ドメインに区分される。LiPのフォールディングモチーフは、8本の主要αヘリックス、8本の副次ヘリックス、および3つの短い逆平行βシートから構成される。

触媒機構

LiPはFe³⁺、ポルフィリン環、およびヘム補欠分子族を含む一連のアイソザイムである。1988年、研究者らは、LiPがH₂O₂および有機過酸化物を用いて一連の基質を触媒し、その触媒作用が非特異的であることを見出した。さらに、LiPはフェノール性および非フェノール性芳香族化合物を含む広範な基質特異性を有し、リグニンのモノマー、ダイマー、トリマー、ならびに多環芳香族炭化水素（例：ベンゾピレン）などの基質を酸化できることが示されている。リグニンペルオキシダーゼの触媒サイクルは3段階からなる。第1段階では、静止状態の三価鉄酵素［Fe(III)］が電子受容体として過酸化水素（H₂O₂）により酸化され、コンパウンドIであるオキソフェリル中間体が形成される。第2段階では、2e⁻欠損のオキソフェリル中間体が、非フェノール性芳香族基質（S）などの基質分子により還元され、基質が1電子（1e⁻）をコンパウンドIへ供与することで、第2の中間体であるコンパウンドII（1e⁻欠損）が生成する。最終段階では、還元型基質からコンパウンドIIへ第2電子が供与され、LiPは静止状態の三価鉄酸化状態へ戻り、これにより酸化サイクルが完結する。

図2．LiPの触媒反応。（Falade A O. et al. 2016）

活性測定

LiPの酵素活性は主としてレスベラトロール酸化速度法により測定される。レスベラトロールはLiP作用の直接基質であるため、310 nmにおけるレスベラトロールの吸光度に基づいてLiP活性を算出する。具体的方法は以下のとおりである。反応液1 mLは、レスベラトロール溶液0.2 mL、酒石酸緩衝液（250 mmoL/L、pH 3.0）0.4 mL、培養液または希釈液0.4 mL、および20 mmoL/L H₂O₂溶液20 μLを含み、30℃で2分間反応させる。310 nmにおける吸光度を測定する。対照群では、H₂O₂溶液を蒸留水に置換し、その他の反応成分は同一とする。

応用

飼料産業において、LiPはわら中のリグニンおよびセルロースの分解に用いられ、わらの嗜好性を改善するとともに、消化・吸収を容易にする。農薬産業において、Phanerochaete chrysosporium 由来のLiPは多様なポリフェノールを酸化でき、これらポリフェノールの一部は広域スペクトルの殺生物剤または除草剤の前駆体として用いられることが多い。製紙パルプ産業では、パルプをLiP単独または他酵素との適切な組合せで処理することにより、得られる紙の引張強度および平滑性が良好となり、紙の白色度を向上させるとともにカッパー価を低減できる。LiPは2,4-ジブロモフェノールなどの工業排水を処理し、酸化過程でダイマー、トリマー、テトラマーを形成することで排水の毒性を低減する。

参考文献