ラッカーゼ

ラッカーゼは青色酸化酵素ファミリーに属するポリフェノールオキシダーゼであり、重要なリグノセルロース分解酵素の一つです。ラッカーゼは最初にトキシコデンドロン・バーニシフルムで発見されました。その後、特定の真菌もラッカーゼを分泌することがわかりました。ラッカーゼはさまざまな芳香族化合物、特にフェノールの分解を触媒することができ、自然で環境に優しい酵素です。ラッカーゼによる木材繊維や一部のポリマー化合物の分解の合理的な開発は、化学物質の使用を減らし、生産コストを削減し、環境を保護することができます。

図1. ラッカーゼIIIのX線決定結晶構造。(C.F. Blanford. 2007)

出典

ラッカーゼは1883年に吉田によってトキシコデンドロン・バーニシフルムで最初に発見されました。その後、特定の真菌もこの酵素を分泌できることが発見されました。これらのタンパク質は、出所によって異なる分子量を持ち、約59-390 kDです。一部の株が生成するラッカーゼは、いくつかのアイソザイムで構成されており、どちらもモノマー酵素です。酵素分子は一般的に4つの銅原子を含んでいます。ラッカーゼの適切な反応温度は低く、酸性環境での触媒効率は比較的高く、基質特異性が得られます。ラッカーゼを分泌する主な真菌には、ファネロチャエテ・クリソスポリウム、コリオラス・バージカラー、トラメテス・バージカラー、プレウロタス・オストレアタス、およびシイタケが含まれ、すべてバシジオマイセテスに属します。ラッカーゼは植物におけるリグニンの合成において主要な役割を果たしますが、真菌が分泌するラッカーゼは正反対の作用をし、主にリグニンを分解します。したがって、真菌ラッカーゼによるリグニンの分解は、幅広い応用が可能です。

分子構造

ラッカーゼの一次構造は、約500のアミノ酸残基からなる3つの連続したドメインに分かれたギリシャの鍵型ベータバレルトポロジーで構成されています。これらのアミノ酸は3つのドメインに分布しており、最初のドメインには150の初期アミノ酸、2番目のドメインには150および300のアミノ酸、3番目のドメインには300–500のアミノ酸があります。ラッカーゼ構造の安定化は、ドメインIとIIおよびドメインIとIIIの間のジスルフィド結合の存在によるものです。

ラッカーゼは、タンパク質単位あたり4つの異なるCu触媒形態が存在することが知られています。これらの4つのCuイオンは、3種類の構造に分かれています。

図2. ラッカーゼの銅中心：タイプ1、タイプ2、タイプ3。(Agrawal K. et al. 2018)

タイプ1の銅は、多銅タンパク質に青色を与え、これは共有結合した銅–システイン結合によって引き起こされる強い電子吸収によるものです。タイプ1の銅は三角形の配位を持ち、2つのヒスチジンと1つのシステインが保存された赤道配位子として機能し、1つの位置は通常変動します。真菌ラッカーゼの場合、軸配位子はロイシンまたはフェニルアラニンです。

タイプ2または通常のCu部位は、可視領域での強い吸収特性が欠如していることが特徴で、通常の電子パラマグネティック共鳴（EPR）スペクトルを示します。タイプ2の銅は2つのヒスチジン残基によって配位され、タイプ3の銅に近い戦略的な位置に配置されています。

タイプ3は、6つのヒスチジンによって調節される二核中心であり、330 nm（酸化型）での電子吸収によって分光学的に特徴付けられ、2つのタイプ3銅原子間の強い反強磁性結合によるEPR信号の欠如が見られます。これは水酸橋の存在に関連しています。

検出方法

現在、ラッカーゼを検出する最も一般的な方法は、ラッカーゼと特定の物質を使用して短時間で色の変化を生じさせる直感的な方法です。例えば、ラッカーゼはシリンガルダジン、グアイアコール、α-ナフタール、ピロガル酸、クエン酸などの物質と反応し、特定の色の物質を迅速に生成します。ラッカーゼとこれらの物質の特定の色変化反応に基づいて、株がラッカーゼを生成するかどうかが判断されます。ラッカーゼの生成量は、同じ時間に生成された色の深さと色の円のサイズに基づいて推定できます。

発酵条件

Kirk et al.は、広範な研究を通じて真菌発酵プロセスにおけるラッカーゼの最適な生成条件を得ました。この研究で特定された基本的な培地は、研究者によって広く使用されています。この研究では、ラッカーゼ発酵プロセスにおける窒素源の種類がラッカーゼの生成に大きな影響を与えないことがわかり、窒素の投与量がラッカーゼの生成に影響を与える重要な要因の一つであることが示されました。窒素制限培養は、ラッカーゼの生成を大幅に増加させることができます。ラッカーゼは銅を含むポリフェノールオキシダーゼであるため、Cu²⁺はラッカーゼの合成と活性に不可欠です。リグニンやリグニン分解フラグメントに構造が類似した低分子の芳香族化合物も、ラッカーゼの生成を誘導し、著しく増加させることができます。例えば、グアイアコール、ベンジルアルコール、レスベラトロール、バニリン酸、ツイーンなどです。炭素含量を制限することもラッカーゼの生成を大幅に増加させることができます。フランスのガリアーノ et al.は、固体培地と液体培地を比較しました。固体培地におけるリグニン分解は、14C放射性同位体標識法によって液体培地よりも著しく高く、生成されたラッカーゼの量は15倍高かったです。

応用

図3. 様々な産業およびバイオテクノロジー分野におけるラッカーゼの応用。(Agrawal K. et al. 2018)

パルピングプロセスは、植物のセルロースをリグニンから分離するものであり、パルプからリグニンを除去する必要があります。バイオパルピングは、微生物発酵によって生成されるさまざまな酵素に主に依存してリグニンを除去し、化学薬品の使用を減らし、環境保護と生産コストの削減を図ります。ラッカーゼはリグニンを選択的に分解し、機械的パルピングプロセスの欠点を排除することができるため、通常の温度と圧力の穏やかな条件下で生産を行うことができ、設備とエネルギー消費を節約し、パルプ生産サイクルを短縮し、生産コストを削減することができます。

緑色植物は陸上バイオマスの95%以上を占めています。緑色植物の合理的な利用は、エネルギー問題を解決するための効果的な方法です。植物のリグニン、セルロース、ヘミセルロースの比率は、植物の乾燥重量に対してそれぞれ20%、45%、20%です。その中で、リグニンの分解と利用が最も難しいです。これらのバイオマス資源を完全に分解し利用するために解決しなければならない最初の問題は、リグニンの分解です。ラッカーゼを使用してリグニンを小さな分子に分解し、バイオ発酵を行い、バイオアルコールなどの新しいエネルギー源を生み出します。

ラッカーゼは食品産業でも広く使用されています。グルコースの安定性を高めることは、食品産業におけるラッカーゼの主要な応用です。ラッカーゼの添加により、ワインの安定性が向上し、使用される二酸化硫黄の量が減少します。さらに、ラッカーゼは果汁の生産においても非常に良い役割を果たすことができます。なぜなら、フェノールの過剰酸化は製品の品質に影響を与え、ラッカーゼはジュース中のカテコールなどのフェノール性物質を除去できるからです。したがって、果汁は追加の澄明剤なしで安定して澄明化されることができます。

参考文献