ラッカーゼ

ラッカーゼはブルーオキシダーゼファミリーに属するポリフェノールオキシダーゼであり、重要なリグノセルロース分解酵素の一つである。ラッカーゼは最初にtoxicodendron vernicifluumで発見された。その後、特定の真菌もラッカーゼを分泌することが見出された。ラッカーゼは多様な芳香族化合物、特にフェノール類の分解を触媒できる天然由来の環境負荷低減型酵素である。ラッカーゼによる木質繊維および一部高分子化合物の分解を合理的に開発・適用することで、化学薬品の使用量削減、製造コスト低減、ならびに環境保全に寄与し得る。

図1．X線解析により決定されたラッカーゼIIIの結晶構造（C.F. Blanford, 2007）

由来

ラッカーゼは1883年にYoshidaによりoxicodendron vernicifluumで初めて発見された。その後、特定の真菌も本酵素を分泌し得ることが明らかとなった。これらのタンパク質は由来により分子量が異なり、概ね59～390 kDである。一部株が産生するラッカーゼは複数のアイソザイムから構成され、いずれも単量体酵素である。酵素分子は一般に4個の銅原子を含有する。ラッカーゼの至適反応温度は低めで、酸性環境下での触媒効率が比較的高く、基質特異性を有する。ラッカーゼを分泌する主要な真菌として、Phanerochaete chrysosporium、Coriolus versicolor、Trametes versicolor、Pleurotus ostreatus、ならびにシイタケが挙げられ、いずれもBasidiomycetes（担子菌類）に属する。ラッカーゼは植物におけるリグニン合成で主要な役割を担う一方、真菌が分泌するラッカーゼはこれと逆に、主としてリグニン分解に作用する。したがって、真菌由来ラッカーゼによるリグニン分解は幅広い応用可能性を有する。

分子構造

ラッカーゼの一次構造は、約500残基のアミノ酸からなる3つの連続ドメインで構成され、ギリシャキー型βバレル・トポロジーを呈する。これらのアミノ酸は、最初の150残基からなる第1ドメイン、150～300残基からなる第2ドメイン、300～500残基からなる第3ドメインに分布する。ラッカーゼ構造の安定化には、第Iドメインと第IIドメイン間、および第Iドメインと第IIIドメイン間に存在するジスルフィド結合が寄与する。

ラッカーゼは、タンパク質ユニット当たり4種類のCu触媒形態で存在することが知られている。これら4つのCuイオンは、3種類の構造タイプに分類される。

図2．ラッカーゼの銅中心：Type 1、Type 2、Type 3（Agrawal K. et al., 2018）

Type 1銅は多銅タンパク質に青色を付与し、これは共有結合性の銅–システイン結合に起因する強い電子吸収による。Type 1銅は三角配位をとり、保存された赤道配位子として2つのヒスチジンと1つのシステインを有し、残る1座は通常可変である。真菌ラッカーゼの場合、軸配位子はロイシンまたはフェニルアラニンである。

Type 2（通常型）Cu部位は、可視領域における強い吸収特性を欠き、典型的な電子常磁性共鳴（EPR）スペクトルを示すことを特徴とする。Type 2銅は2残基のヒスチジンにより配位され、Type 3銅の近傍に戦略的に配置されている。

Type 3は6つのヒスチジンにより制御される二核中心であり、分光学的には330 nm（酸化型）での電子吸収、およびヒドロキシル架橋の存在に関連する2つのType 3銅原子間の強い反強磁性的結合によりEPRシグナルが消失することを特徴とする。

検出方法

現在、ラッカーゼの検出で最も一般的な方法は、ラッカーゼと特定物質を用いて短時間の反応で呈色変化を生じさせる直観的手法であり、滴定法やPDA培地を用いた呈色リング反応法などがある。例えば、ラッカーゼはシリンガルダジン、グアヤコール、α-ナフトール、ピロガロール酸、クエン酸などと反応し、特定色の生成物を迅速に生じる。ラッカーゼとこれら物質との特異的な呈色反応に基づき、当該菌株がラッカーゼを産生するか否かを判定する。同一時間内に生じる色の濃度および呈色リング径に基づき、ラッカーゼ産生量を推定できる。

発酵条件

Kirk et al.は、真菌発酵プロセスにおけるラッカーゼ生産の最適条件を広範な研究により取得した。本研究で同定された基本培地は、研究者により広く使用されている。研究では、ラッカーゼ発酵プロセスにおける窒素源の種類はラッカーゼ生産に有意な影響を及ぼさない一方、窒素添加量がラッカーゼ生産に影響する主要因の一つであることが示された。窒素制限培養はラッカーゼ生産を有意に増加させ得る。ラッカーゼは銅含有ポリフェノールオキシダーゼであるため、Cu²⁺はラッカーゼの合成および活性に必須である。リグニンまたはリグニン分解断片と構造が類似する低分子芳香族化合物も、グアヤコール、ベンジルアルコール、レスベラトロール、バニリン酸、Tweenなどのように、ラッカーゼ生産を誘導し有意に増加させ得る。炭素源を制限することもラッカーゼ生産を有意に増加させ得る。フランスのGalliano et al.は固体培地と液体培地を比較し、14C放射標識法により、固体培地におけるリグニン分解が液体培地より有意に高く、産生されるラッカーゼ量は15倍であることを示した。

応用

図3．各種産業およびバイオテクノロジー分野におけるラッカーゼの応用（Agrawal K. et al., 2018）

パルプ化工程では、植物セルロースをリグニンから分離するため、パルプからリグニンを除去する必要がある。バイオパルプ化は主として微生物発酵により産生される各種酵素に依存してリグニンを除去し、化学薬剤の使用量削減、環境負荷低減、ならびに製造コスト低減を実現する。ラッカーゼはリグニンを選択的に分解し、機械パルプ化工程の欠点を解消し得るため、常温・常圧の温和条件下での生産を可能とし、設備およびエネルギー消費の削減、パルプ製造サイクルの短縮、ならびに製造コスト低減に寄与する。

緑色植物は陸上バイオマスの95%以上を占める。緑色植物の合理的利用はエネルギー問題を解決する有効な手段である。植物乾燥重量に対するリグニン、セルロース、ヘミセルロースの比率はそれぞれ20%、45%、20%である。このうち、リグニンの分解・利用が最も困難である。これらバイオマス資源を完全に分解・利用するためにまず解決すべき課題は、リグニンの分解である。ラッカーゼを用いてリグニンを低分子へ分解し、バイオ発酵に供することで、バイオアルコール等の新規エネルギー源を得ることができる。

ラッカーゼは食品産業においても広く利用されている。グルコースの安定性向上は、食品産業におけるラッカーゼの主要な用途である。ラッカーゼの添加によりワインの安定性が向上し、亜硫酸二酸化物の使用量を低減できる。さらに、果汁製造においてもラッカーゼは有用である。フェノール類の過度な酸化は製品品質に影響するが、ラッカーゼは果汁中のカテコール等のフェノール性物質を除去できる。その結果、追加の清澄剤を用いることなく果汁を安定的に清澄化できる。

参考文献