LAAO（左心耳閉鎖術）

L-アミノ酸オキシダーゼ（LAAO、EC 1.4.3.2）は、酸素を消費しながらL-アミノ酸を特異的に酸化して脱アミノ化を進行させ、α-ケト酸、アンモニアおよびH₂O₂を生成するフラビン酵素である。L-アミノ酸の定量分析、DL-アミノ酸の光学分割、ならびにα-ケト酸の調製に応用可能である。近年の文献報告では、LAAO自体が抗菌活性、殺虫活性、抗ウイルス活性等の生物活性を有し、さらに血小板との相互作用、細胞毒性、アポトーシス誘導能を示すことが報告されている。バイオメディシン領域において極めて広範な応用可能性が期待される。

図1．L-アミノ酸オキシダーゼが触媒する反応の模式図。（Costa T R ほか、2014）

分類

LAAOは、触媒基質の範囲により2つのカテゴリーに分類できる。1つは広い基質範囲を触媒するLAAOであり、例えばRhodococcus erythropolis由来LAAOは20種類のL-アミノ酸に加え、それらの一部誘導体も触媒する。もう1つは基質範囲が狭いLAAOであり、例えばRheinheimera由来LAAOはL-リジンのみに厳密に作用する。さらに補因子の違いにより、LAAOは2つに分類される。すなわち、ヘビ毒、細菌および真菌由来LAAOは二量体で、2分子のFAD補因子を含有する。一方、ラット腎由来LAAOは四量体構造を有し、0.5または1分子のFMN補因子を含有する。

特性

• 基質特異性および至適性

種によりLAAOの基質特異性および至適性は大きく異なる。複数、あるいは数十種類のアミノ酸を触媒できるLAAOがある一方、1種類のアミノ酸のみを触媒するものもある。多くのLAAOはL-アミノ酸のみに作用するが、D-アミノ酸、さらにはアミノ酸誘導体にも作用するものが存在する。ある種では、広い基質特異性を有するLAAOと、狭い基質特異性を有するLAAOの双方を含む。多くのLAAOは疎水性および中性アミノ酸に対して高い触媒活性を示すが、他のタイプのアミノ酸に対して高活性を示すLAAOもある。また、条件の違いにより至適基質が変化し得るLAAOの存在も示唆されている。

• 分子量および等電点

LAAOは多様な生物種に由来する。現在知られているLAAOは一般に、非共有結合で結合した2つのサブユニットから構成される。天然条件下では、ゲルろ過により通常93～150 kDaの範囲の異なる分子量のLAAOが得られる。各サブユニットの分子量は一般に36～70 kDaである。2つの相同サブユニット（同一分子量）からなるLAAOもあれば、2つの非相同サブユニットからなるLAAOもある。本酵素の等電点は4.0～8.5（酸性～中性～塩基性）と幅広い。

• 熱安定性

LAAOは4°Cかつ中性pHで保存した場合、良好な熱安定性を示す。コブラ由来LAAOは70°Cで急速に活性を失うが、60°C未満では一定の熱安定性を有し、熱変性温度は65～70°Cである。ヒガシダイヤガラガラヘビから単離されたLAAOは可逆的な活性を示し、-20°C、高温または強アルカリ条件下で失活する一方、pH=5、37°Cで活性が回復する。Trichoderma viride由来LAAOの熱安定性評価では、55°Cで初期活性の100%、60°Cで92%、65°Cで42%、70°Cでは4%のみが維持された。

構造

現時点でLAAOの構造に関する報告は多くない。マレーシアニシキヘビ由来LAAOは二量体であり、各モノマーの分子量は55 kDaである。15本のαヘリックスおよび22枚のβシートから折り畳まれ、FAD結合ドメイン、基質結合ドメインおよびヘリックスドメインの3ドメインを形成する。基質結合ドメインとヘリックスドメインの間に漏斗状の基質チャネルが形成され、活性部位へ連結する。本酵素には2つの糖鎖付加部位があり、1つはAsn172、もう1つはAsn361に存在する。原核生物であるRhodococcus erythropolis由来LAAOも二量体である。各LAAOモノマーは12本のαヘリックス、26枚のβシートおよび5つの3₁₀ヘリックスから構成され、FAD結合ドメイン、基質結合ドメインおよびヘリックスドメインの3ドメインを形成する。

図2．L-アミノ酸オキシダーゼの構造。（A）LAAOの機能的二量体。（B）LAAOの単一プロトマー。
（Pawelek P D ほか、2000）

一般にLAAOは、細胞内でシグナルペプチドを有する前駆体タンパク質としてまず合成され、その後プロテアーゼ分解により成熟タンパク質となる。これは毒性に起因する可能性がある。すなわち、LAAOがアミノ酸を酸化することで生成されるアンモニアおよびH₂O₂は細胞に対して毒性を示し、細胞増殖に負の影響を及ぼし得る。そのため、LAAOは細胞内では低活性の前駆体として存在し、その後エンドペプチダーゼにより切断されて高活性の成熟タンパク質となり、細胞外へ分泌される。

酵素活性測定

現在、LAAOの酵素活性測定には主として蛍光法および分光光度法の2手法が用いられている。いずれも、LAAOが基質を触媒して生成するH₂O₂の変化量を指標とする。蛍光法は、酵素反応で生成したH₂O₂により非蛍光性のホモバニリン酸を強蛍光性物質へ変換し、反応系の蛍光値の変化に基づいてLAAO活性を算出する。高い精度および感度を有する一方、蛍光寿命が短く消光されやすいため、操作中は光および空気への長時間曝露を回避する必要がある。分光光度法は、酵素反応で生成したH₂O₂が発色基質に作用して特定波長で吸光度を生じることを利用し、反応系の吸光度変化に基づいてLAAO活性を測定する。本法は応答が速く、操作が簡便で、再現性が良好であり、コストが低いという明確な利点を有する。このため、LAAOの酵素活性測定には分光光度法が最も一般的に用いられている。

生物学的機能

• アポトーシス誘導

研究により、ヘビ毒由来LAAOは多様な細胞にアポトーシスを誘導し得ることが示されており、特に血管内皮細胞のアポトーシス誘導に関する報告が多い。LAAOはヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖を抑制し、用量依存的に細胞管腔形成に影響を及ぼすことが示されている。多数の実験により、血管内皮細胞の増殖、遊走および管腔形成は腫瘍増殖における重要なステップであることが確認されている。血管新生の阻害はがん治療におけるブレークスルーとなり得るため、研究者らはLAAOに腫瘍血管新生抑制作用がある可能性を推測している。アポトーシス誘導においては、ヘビ毒LAAOの触媒により生成されるH₂O₂が主要な役割を担う。H₂O₂はアポトーシス促進遺伝子Fasの発現を上方制御し、アポトーシスを惹起する。したがって、LAAO誘導性アポトーシスは、LAAOがL-アミノ酸を触媒して生成するH₂O₂に起因する可能性がある。

• 静菌作用

ガラガラヘビ毒がグラム陽性菌に対して抵抗性（抗菌）作用を有することは古くから知られており、LAAOが抗菌作用に寄与することが示されている。LAAOはEscherichia coliおよびBacillus subtilisの細胞表面に付着し、高濃度のH₂O₂を産生し、この静菌作用は用量依存的である。培地に添加するLAAO量が多いほど、細菌増殖の抑制は強くなる。実験により、少量のペルオキシダーゼがLAAOの静菌作用を抑制し得ることが示されている。細菌種によりLAAO感受性が異なるのは、各菌が産生するペルオキシダーゼ量が不均一であり、酸化作用の相殺程度が異なるためである可能性がある。

• 血小板への作用

研究により、ヘビ毒LAAOの血小板に対する作用については、血小板凝集の抑制または誘導という相反する結果が報告されている。多くの文献では、LAAOがアゴニストおよび剪断応力により誘導される血小板凝集を抑制することが示されている。例えば、Echis colorataのヘビ毒から単離・精製されたLAAOは、アゴニスト（アデノシン二リン酸、ADP）による血小板凝集を用量依存的に抑制する。しかし一方で、コブラ毒由来LAAOが血小板多血漿中で血小板凝集を誘導し得ること、またサルコシンリン酸およびサルコシンホスホキナーゼがコロブス由来LAAOによる血小板凝集を阻害できないことも報告されている。この矛盾する結論を正確に説明することはできないが、いずれの相反する作用においてもH₂O₂が重要な役割を果たすことは確かである。

参考文献