LAAO

L-アミノ酸オキシダーゼ（LAAO、EC 1.4.3.2）は、L-アミノ酸を特異的に酸化して脱アミノ化し、α-ケト酸、アンモニア、H₂O₂を生成するフラビンプロテアーゼであり、酸素を消費します。L-アミノ酸の定量分析、DL-アミノ酸の分解、α-ケト酸の調製に応用できます。近年、文献ではLAAO自体が抗菌、殺虫、抗ウイルスおよびその他の生物学的活性を持ち、血小板との相互作用、細胞毒性、アポトーシスの誘導機能も持つことが報告されています。生物医学の分野で非常に広い応用の見込みがあります。

図1. L-アミノ酸オキシダーゼによって触媒される反応の表現。(Costa T R, et al. 2014)

分類

LAAOは、触媒基質の範囲に応じて2つのカテゴリに分けることができます。1つのクラスのLAAOは、Rhodococcus erythropolis LAAOのように、20種類のL-アミノ酸だけでなく、そのいくつかの誘導体も触媒する広範な基質を触媒します。もう1つのクラスのLAAOは、L-リジンのみに厳密に作用するRheinheimera LAAOのように、より狭い範囲の基質を触媒します。異なる補因子に応じて、LAAOは2つのカテゴリに分けることもできます。蛇の毒、細菌および真菌のLAAOは二量体であり、2つのFAD補因子を含みます。一方、ラット腎LAAOは四量体構造を持ち、0.5または1のFMN補因子を含みます。

特性

• 基質特異性と最適性

異なる種からのLAAOの基質特異性と最適性は非常に異なります。一部のLAAOは数種類または数十種類のアミノ酸を触媒できますが、一部は1種類のアミノ酸しか触媒できません。ほとんどのLAAOはL-アミノ酸にのみ作用しますが、他のものはD-アミノ酸やアミノ酸誘導体にも作用できます。一部の種には、広範な基質特異性を持つLAAOと狭い基質特異性を持つLAAOの両方が含まれています。多くのLAAOは疎水性および中性アミノ酸に対して高い触媒活性を持ちますが、一部のLAAOは他のタイプのアミノ酸に対して高い活性を持ちます。研究では、いくつかのLAAOが異なる条件下で異なる最適基質を持つ可能性があることも発見されました。

• 分子量と等電点

LAAOは広範な供給源を持っています。現在知られているLAAOは、一般的に2つの非共有結合したサブユニットで構成されています。自然条件下では、ゲル濾過により異なる分子量のLAAOを得ることができ、その範囲は通常93-150 kDaです。各サブユニットの分子量は一般的に36-70 kDaです。一部のLAAOは同じ分子量を持つ2つのホモログサブユニットで構成されているのに対し、他のLAAOは2つの非ホモログサブユニットで構成されています。この酵素の等電点は広範に変動し、4.0-8.5（酸性、中性、アルカリ性）です。

• 熱安定性

LAAOは4°Cおよび中性pHで保存されると良好な熱安定性を示します。コブラLAAOは70°Cで急速に活性を失いますが、60°C以下では一定の熱安定性を持ち、その熱変性温度は65-70°Cです。東部斑点ガラガラヘビから分離されたLAAOは可逆的な活性を持ち、-20°C、高温または強アルカリ条件下で不活化され、pH=5、37°Cで回復できます。Trichoderma viride LAAOの熱安定性の研究では、55°Cで元の活性の100%、60°Cで元の活性の92%、65°Cで元の活性の42%、70°Cで元の活性のわずか4%に達することが示されました。

構造

現在、LAAOの構造に関する報告はほとんどありません。マレーシアのニシキヘビLAAOは二量体です。各モノマーの分子量は55 kDaです。15のαヘリックスと22のβシートによって折りたたまれ、FAD結合ドメイン、基質結合ドメイン、ヘリックスドメインの3つのドメインを形成します。基質結合ドメインとヘリックスドメインの間には漏斗状の基質チャネルが形成され、活性部位と結合します。酵素には2つの糖鎖修飾部位があり、1つはAsn172、もう1つはAsn361にあります。原核生物のRhodococcus erythropolis LAAOも二量体です。各LAAOモノマーは12のαヘリックス、26のβシート、5つの3₁₀ヘリックス折りたたみから構成され、FAD結合ドメイン、基質結合ドメイン、ヘリックスドメインの3つのドメインを形成します。

図2. L-アミノ酸オキシダーゼの構造。(A) LAAOの機能的二量体。(B) LAAOの単一プロトマー。
(Pawelek P D, et al. 2000)

一般的に、LAAOは細胞内でシグナルペプチドを持つ前駆体タンパク質として最初に合成され、その後プロテオリシスによって成熟タンパク質になります。これは、その毒性、すなわちLAAOがアミノ酸を酸化することによって生成されるアンモニアとH₂O₂が細胞に対して毒性を持ち、細胞の成長に悪影響を与えるためかもしれません。したがって、LAAOは細胞内で最初はあまり活性のない前駆体として存在し、その後エンドペプチダーゼによって高度に活性な成熟タンパク質に切断され、細胞外に分泌されます。

酵素活性測定

現在、LAAOの酵素活性を検出するために一般的に使用される方法は2つあり、すなわち蛍光法と分光光度法です。これらの方法は、LAAOが触媒する基質によって生成されるH₂O₂の変化量を測定することに基づいています。蛍光法は、酵素反応によって生成されたH₂O₂が非蛍光性の高バニリル酸を強い蛍光を持つ物質に変換し、反応系の蛍光値の変化に基づいてLAAOの酵素活性を測定します。この方法は高い精度と感度を持っていますが、蛍光寿命が短く、消光しやすいため、操作中は光や空気への長時間の曝露を避ける必要があります。分光光度法は、酵素反応によって生成されたH₂O₂が色素物質に作用して特定の波長で吸光度を生成し、反応系の吸光度の変化に基づいてLAAOの酵素活性を測定します。この方法は、応答が速く、操作が簡単で、再現性が良く、低価格という明らかな利点があります。したがって、分光光度法はLAAOの酵素活性を測定するために最も一般的に使用される方法です。

生物学的機能

• アポトーシスの誘導

研究によると、蛇の毒LAAOはさまざまな細胞のアポトーシスを誘導することができ、その中でも血管内皮細胞のアポトーシス誘導に関する報告が多くあります。研究では、LAAOがヒト臍帯静脈内皮細胞の成長を抑制し、細胞チューブの形成に影響を与えることが用量依存的に示されています。多くの実験が、血管内皮細胞の増殖、移動、チューブ形成が腫瘍成長の重要なステップであることを確認しています。血管新生の抑制は癌治療の突破口になると期待されているため、研究者たちはLAAOが腫瘍の血管新生を抑制する効果を持つと推測しています。アポトーシスの誘導において、蛇の毒LAAO触媒によって生成されるH₂O₂が主要な役割を果たします。H₂O₂はアポトーシス促進遺伝子Fasの発現を上昇させ、アポトーシスを引き起こします。したがって、LAAOによって誘導されるアポトーシスは、LAAOがL-アミノ酸を触媒することによって生成されるH₂O₂によるものかもしれません。

• 抗菌効果

ガラガラヘビの毒がグラム陽性菌に対して抵抗する効果を持つことは長い間知られており、研究によってLAAOが抗菌作用を持つことが示されています。LAAOはEscherichia coliおよびBacillus subtilisの細胞表面に付着し、高濃度のH₂O₂を生成し、この抗菌効果は用量依存的です。培地に追加されるLAAOが多いほど、細菌の成長抑制が強くなります。実験では、少量のペルオキシダーゼがLAAOの抗菌作用を抑制できることが示されています。異なる細菌のLAAOに対する感受性は、異なる細菌が不均等な量のペルオキシダーゼを生成し、酸化に対する異なる程度の相殺をもたらすことに起因する可能性があります。

• 血小板への影響

研究によると、蛇の毒LAAOの血小板に対する役割には、抑制または誘導の2つの矛盾した結果があります。多くの文献は、LAAOがアゴニストやせん断力によって誘導される血小板凝集を抑制することを示しています。たとえば、Echis colorataの蛇の毒から分離・精製されたLAAOは、アゴニスト（アデノシン二リン酸、ADP）によって引き起こされる血小板凝集を用量抑制します。しかし、コブラの毒LAAOが血小板豊富な血漿中で血小板凝集を誘導できるという報告もあり、サルコシンリン酸およびサルコシンホスホキナーゼはコロブスLAAOによって誘導される血小板凝集を抑制できません。この矛盾した結論を正確に説明することはできませんが、1つ確かなことは、H₂O₂がこれら2つの対立する役割において重要な役割を果たしているということです。

参考文献