ヘパリナーゼ

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序論

ヘパリナーゼは、ヘパリンまたはアセチル化ヘパリン分子に作用する多糖切断酵素群である。ヘパリナーゼには、切断反応によりヘパリンまたはアセチル化ヘパラン硫酸を分解する微生物由来酵素と、加水分解によりアセチル化ヘパラン硫酸を分解する動物由来の内因性（ヘパラナーゼ様）酵素の両方が含まれる。

由来

ヘパラナーゼは主として、炭素源としてヘパリンを利用する一部の細菌から単離され、当初は Flavobacterium heparinum 由来として報告された。さらに、Corynebacterium 属など多くの微生物においてもヘパリナーゼの存在が確認されている。しかし、商業的に供給されているヘパリナーゼの供給源は依然として Flavobacterium heparinum のみである。Heparinibacterium heparinum からは、酵素学的特性の異なるヘパリナーゼ I、II、III の3種が単離・精製されている。Flavobacterium heparinum 由来として精製された3種のヘパリナーゼのうち、立体構造が解明されているのはヘパリナーゼ II のみであり、基質特異性が最も低い。一方、ヘパリナーゼ I は低分子量ヘパリンの製造に最も適している。

特性

ヘパラナーゼは、硫酸化ヘパリン糖鎖中のグルコサミンとグリオキシレート間の α(1-4) グリコシド結合を選択的に切断し、3種のヘパラナーゼ（酵素 I、酵素 II、酵素 III）はそれぞれ特異性が大きく異なる。ヘパラナーゼ I は、グルコサミンと O-アイドウロン酸硫酸の間におけるヘパリンおよびアセチル化ヘパラン硫酸の結合を切断し（相対活性は約3:1）、主生成物は二糖である。本酵素はまた、ヘパリン分子内のアンチトロンビン III 結合五糖配列部位も切断する。

活性

ヘパラナーゼは、硫酸化ヘパラン糖鎖中のグルコサミンとグルクロン酸の間の α(1-4) グリコシド結合を選択的に切断し、3種のヘパラナーゼ（酵素 I、酵素 II、酵素 III）はそれぞれ特異性が大きく異なる。ヘパラナーゼ III は、ヘキソサミンとグルクロン酸の間の 1-4 結合部位でヘパラン硫酸を切断し、主として二糖を生成する。本酵素はヘパリンおよび低分子量ヘパリンには作用しない。

用途

ヘパリナーゼには多くの重要な医薬用途があり、主な用途は以下のとおりである。

(1) 低分子量および超低分子量ヘパリンの製造

低分子量および超低分子量ヘパリンは抗凝固作用を有し、血管増殖の抑制、腫瘍転移の予防、がん治療、抗アレルギーなどにおいて特有の効果を示す。ヘパリナーゼによる低分子量ヘパリンの製造は、反応条件が温和で環境負荷が低く、かつ硫酸基に作用しないため、工業的製造法として理想的である。

(2) in vitro における循環血液からのヘパリン除去

尿毒症患者など一部の重症患者では、手術中に体外循環が必要となり、その際に血液凝固を防止する目的でヘパリンが添加される。血中にヘパリンが残存して凝固能に影響を及ぼすことを防ぐため、臨床ではヘパリン中和の目的でフィセチンが投与される。臨床研究により、フィセチンは血小板に重篤な障害を与え、動脈血圧の安定性にも影響することが示されている一方、ヘパリナーゼには同様の副作用がなく、したがって理想的な代替材料である。なお、ヘパリナーゼは細胞外マトリックスも分解するため、血液の脱ヘパリン化に用いるヘパリナーゼは固定化する必要があり、さらに免疫原性を有しないことが求められる。

(3) ヘパリンの精密構造決定

解析対象のヘパリンは、まず Heparin Flavobacterium 由来の精製ヘパリナーゼにより分解して四糖生成物を得た後、同じく Heparin Flavobacterium 由来の精製アセチルヘパリナーゼによりさらに深分解を行い、最終生成物の解析により対応するヘパリンの構造を推定する。