FDH

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はじめに

NAD⁺依存性ギ酸脱水素酵素（EC 1.2.1.2、FDH）は、ギ酸イオンの二酸化炭素への酸化を触媒すると同時に、NAD⁺をNADHへ還元する酵素である。本酵素はエンドウ種子で最初に見出され、1970年代には主としてメチロトローフ細菌および酵母由来のギ酸脱水素酵素を対象に集中的な研究が行われた。FDHは、2-ヒドロキシ酸のD特異的脱水素酵素スーパーファミリーに属し、活性中心が類似した構造を有し、触媒に必須のアミノ酸残基がほぼ同一であることを特徴とする。本酵素が、当該スーパーファミリーの他酵素と比較して、プロトンの放出または引き抜きの段階を伴わない最も単純な反応を触媒することから、FDHはモデル酵素として選択されることが多い。

過去10年間で、Staphylococcus aureus、Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis str.k10、各種BordetellaおよびLegionella株、Histoplasma capsulatum、Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC21などの病原体を含む多様な生物においてFDH遺伝子が同定されている。多数の研究により、特定条件下でFDHが細胞機能において重要な役割を果たし得ることが示されている。例えば、植物ではFDHがストレス応答タンパク質として機能すると考えられている。FDHはミトコンドリアに局在し、ストレス条件下ではその生合成が著しく増加し、ミトコンドリア総タンパク質の最大9%に達する。真菌性病原体においても、FDH遺伝子の発現はステージ特異的である。

光学活性化合物の補酵素共役型酵素合成におけるNAD(P)H再生の一般的スキームを図に示す。主酵素E_p（脱水素酵素、還元酵素、モノオキシゲナーゼ等）は還元型補酵素を用いてキラル化合物の生成を触媒し、第二酵素E_R（ギ酸脱水素酵素など）が酸化型補酵素をNAD(P)Hへ還元する。多くのエビデンスから、FDHは還元型補酵素再生に最適な酵素の一つであることが示唆されている。FDHが触媒する反応は、NAD(P)H再生に求められる要件をすべて満たす。

図1．光学活性化合物の補酵素共役型酵素合成におけるNAD(P)H再生の一般的スキーム

FDHエンジニアリングに適用された構造解析

X線データ解析により、Pseudomonas sp.101由来FDHおよび高い相同性（アミノ酸残基2箇所のみが相違）を有するMycobacterium vaccae N10由来FDHについて、変異導入部位が選定された。1993年に、apo-PseFDH（2NAC）および三者複合体（PseFDH–NAD⁺–アジド）（2NAD）の高分解能構造が取得された。ギ酸、ADP-リボース、NADH、ならびに（NADH＋ギ酸）との複合体におけるPseFDH構造解析から、これらが2NACと2NAD構造の中間的特徴、すなわちapo酵素からholo酵素への変換過程を示すことが明らかとなった。これらの複合体はいずれも、Pseudomonas sp.101から精製したネイティブ酵素を用いて得られている。組換えwt-PseFDHタンパク質のC末端に付加された7残基の存在は結晶化を阻害した。変異導入により当該残基を除去することで、組換えFDH結晶の取得に成功した。全長400アミノ酸のポリペプチド結晶から、熱安定性が改善した2種の変異体、すなわちPseFDHGAVおよびPseFDH T7が得られた。

研究者らは、多数の試行にもかかわらず、野生型CboFDHの構造データを解決できなかった。必要なCboFDH結晶を得るため、高度に無秩序な領域にアミノ酸置換を導入する手法が適用された。特定のプログラムおよび相同酵素の構造を用いて、これら領域における新規酵素（配列）を予測する。CboFDHでは、本手法により以下の変異が導入された：Lys47Val、Lys47Glu、Arg296Ala、Lys328Val、Lys338Ala。CboFDHにおけるLys47Glu置換により高品質結晶の調製に成功し、最終的に分解能1.9 Åのapo酵素構造が得られた。なお、Lys47（PseFDHではLys75）は、これまでに知られているFDHの完全配列および部分配列51種すべてで保存されている。

C. boidinii由来FDHの触媒活性の向上

FDHの欠点の一つは触媒活性が低いことである。報告によれば、細菌由来酵素は比較的高い比活性を示す。30 ℃において、PseFDHの比活性はタンパク質1 mg当たり約10 Uである。他の由来の酵素は細菌由来FDHほど活性が高くなく、CboFDHの活性は約6.1～6.3 U/mg（30 ℃）である。しかし、これら酵素の分子量が異なる（細菌由来酵素44,000 Da、酵母由来酵素40,370 Da）ため、PseFDHとCboFDHのk_cat値はそれぞれ7.3 s^-1および3.7 s^-1と大きく異なる。CboFDHのランダム変異により作製されたクローンの中から、野生型CboFDHより高い酵素比活性を示すクローンが同定された。この結果に基づき、研究者らはCboFDH Phe285Tyrを作製した。当該変異は酵素活性に影響しない一方で、熱安定性を向上させた。FDHにおけるPhe285（PseFDHでは311）残基は、触媒上重要なGln287（PseFDHでは313）残基に対して−2位に位置し、基質結合チャネル部位の酵素活性中心入口に存在する。Phe285Ser置換によりCboFDH活性は最大9.1 U/mgまで増加するが、酵素の熱安定性には影響せず、補酵素およびギ酸に対するK_m値がわずかに悪化した。

図2．三者複合体（PseFDH–NAD⁺–アジド）（構造2NAD）におけるPhe311PseFDH（Phe285CboFDH）（ピンクで表示）の位置