FDH

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はじめに

NAD⁺-依存性フォルミルデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.2、FDH）は、フォルミルイオンを二酸化炭素に酸化し、同時にNAD⁺ をNADHに還元する触媒反応を担っています。この酵素は最初にエンドウ豆の種子で発見され、1970年代には主にメチロトロフ細菌や酵母からのフォルミルデヒドロゲナーゼに関して集中的な研究が行われました。FDHは、2-ヒドロキシ酸のD特異的脱水素酵素のスーパーファミリーに属し、その活性中心は類似の構造を持ち、ほぼ同じ触媒に必須なアミノ酸残基を有することが特徴です。この酵素は、プロトンの放出や抽出ステップを伴わないスーパーファミリーの他の酵素の中で最も単純な反応を触媒するため、FDHはしばしばモデル酵素として選ばれます。

過去10年間で、FDH遺伝子はStaphylococcus aureus, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis str.k10、さまざまな株のBordetella やLegionella, Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC21などの病原体を含むさまざまな生物で発見されました。多くの研究が、特定の条件下でFDHが細胞機能において重要な役割を果たすことを示しています。例えば、FDHは植物におけるストレスタンパク質のようです。ミトコンドリアに局在し、ストレス条件下でその生合成が劇的に増加し、総ミトコンドリアタンパク質の最大9%を占めます。FDH遺伝子の発現は、真菌病原体においても段階特異的です。

光学活性化合物の補因子結合酵素合成のためのNAD(P)H再生の一般的なスキームは、図に示されています。主要な酵素E_p （脱水素酵素、還元酵素、モノオキシゲナーゼ、 等）は、還元補因子を使用してキラル化合物の生成を触媒し、二次酵素E_R （フォルミルデヒドロゲナーゼなど）は酸化コエンザイムをNAD(P)Hに還元します。多くの証拠が、FDHが還元補因子再生のための最良の酵素の一つであることを示しています。FDHによって触媒される反応は、NAD(P)H再生のすべての基準に適合します。

図1. 光学活性化合物の補因子結合酵素合成のためのNAD(P)H再生の一般的なスキーム

FDH工学に適用される構造解析

X線データ解析を使用して、Pseudomonas sp.101 および高い相同性を持つ（アミノ酸残基が2つ異なるのみ）Mycobacterium vaccae N10からのFDHの変異位置を選択しました。1993年には、アポ-PseFDH（2NAC）および三量体複合体（PseFDH NAD⁺-アジ化物）（2NAD）の高解像度構造が得られました。フォルミル、ADP-リボース、NADHおよび（NADH + フォルミル）との複合体におけるPseFDH構造の分析は、2NACと2NAD構造の中間的な特徴を明らかにし、すなわちアポ酵素がホロ酵素に変換されることを示しました。すべての複合体は、Pseudomonas sp.101から精製された天然酵素で得られました。組換えwt-PseFDHタンパク質のC末端における7つの追加アミノ酸残基の存在は、結晶化を妨げます。これらの残基を突然変異によって除去することにより、組換えFDH結晶が成功裏に得られました。全長400 aaポリペプチド結晶は、熱安定性が向上した2つの変異体、すなわちPseFDHGAVおよびPseFDH T7を生成しました。

科学者たちは、多くの試みの後、野生型CboFDHの構造データを解決することに失敗しました。必要なCboFDH結晶を得るために、高度に無秩序な領域におけるアミノ酸置換の導入に基づく方法が適用されました。特別なプログラムを使用し、相同酵素の構造を利用して、これらの領域における新しい酵素を予測します。CboFDHの場合、この方法を使用して以下の変異を導入しました：Lys47Val、Lys47Glu、Arg296Ala、Lys328ValおよびLys338Ala。CboFDHにおけるLys47Gluの置換は、高品質の結晶を成功裏に準備し、最終的に1.9 Åの解像度を持つアポ酵素構造を得ました。Lys47（PseFDHではLys75）は、これまでに知られている51のFDH完全および部分配列のすべてに保存されています。

由来のFDHの触媒活性の向上

FDHの欠点の一つは、その低い触媒活性です。報告によると、細菌酵素の特異的活性は比較的高いです。30 °CでのPseFDHの特異的活性は約10 U/mgのタンパク質です。他の供給源からの酵素は細菌FDHほど活性ではなく、CboFDHの活性は約6.1-6.3 U/mg（30 °C）です。 しかし、これらの酵素の分子量が異なるため（細菌酵素は44,000 Da、酵母酵素は40,370 Da）、PseFDHとCboFDHのk_cat の値は非常に異なり、それぞれ7.3および3.7 s^-1 です。CboFDHのランダム変異によって生成されたクローンの中で、野生型CboFDHよりも高い酵素特異的活性を持つクローンが特定されました。この結果に基づいて、科学者たちはCboFDH Phe285Tyrを生成しました。この変異は酵素活性に影響を与えませんが、熱安定性を向上させます。FDHにおけるPhe285（311 PseFDH）残基は、基質結合チャネルの酵素活性中心の入口に位置する触媒に重要なGln287（313 PseFDH）残基に対して-2位置にあります。Phe285Serの置換によって引き起こされるCboFDH活性の増加は最大9.1 U/mgであり、酵素の熱安定性には影響を与えませんが、コエンザイムおよびフォルミルのK_m 値をわずかに悪化させました。

図2. 三量体複合体（PseFDH-NAD+ -アジ化物）におけるPhe311PseFDH（Phe285CboFDH）の位置（ピンク色でマーク）（構造2NAD）。