DNAポリメラーゼ

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はじめに

DNAポリメラーゼは、生命体の細胞内のDNAをテンプレートとして、相補的なDNA鎖を合成する普遍的な酵素です。各生物から多くの酵素が同定されており、これらの酵素の共通機能を調査するための多くの研究が行われています。複製や修復中のゲノムの完全性を維持する役割に加えて、DNAポリメラーゼは、DNAクローニング、配列決定、ラベリング、突然変異誘発などのin vitroでのDNA操作においても重要な役割を果たします。DNAポリメラーゼがデオキシリボヌクレオチド鎖を合成する能力は保存されています。しかし、そのプロセシビティ、忠実度（合成精度）、基質ヌクレオチド選択性は酵素間で大きく異なります。各DNAポリメラーゼの異なる特性を活用することで、ユニークな試薬の開発が促進されるため、新しいDNAポリメラーゼの探索はこの研究分野の主要な焦点の一つとなっています。近年、さまざまな特定の目的のために、タンパク質工学技術を用いて強力なDNAポリメラーゼが成功裏に開発されています。熱安定性のあるDNAポリメラーゼは、分子生物学におけるPCR関連技術にとって特に重要です。

図1. DNAポリメラーゼの三つの生命のドメインにおける分布 (Ishino, S.; Ishino, Y. 2014)

始まり: Taqポリメラーゼ

最も代表的な熱安定性DNAポリメラーゼは、Thermus aquaticusからのDNAポリメラーゼI、すなわちTaqポリメラーゼです。Taqポリメラーゼは、アメリカ・モンタナ州のイエローストーン国立公園で分離されたT. aquaticusから最初に同定され、Chien et al.によって発表されましたが、この酵素がこれほど有名になるとは誰も予想していませんでした。Escherichia coliのDNAポリメラーゼIのクレノウフ断片を使用したPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）技術は1985年に報告されました。二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性する過程で不活性化しない熱安定性DNAポリメラーゼは、PCR法を広範な実用技術に変える上で重要な役割を果たしました。その後、Taqポリメラーゼを使用したシンプルで信頼性の高いPCR法が発明されました。Taqポリメラーゼの優れた熱安定性により、DNAポリメラーゼを含む反応混合物を準備した後、反応チューブはインキュベーターに置いたままにでき、実験中に温度を変更するだけで済みました。

PCRキットと反応温度を迅速に変更できる機器は、PCR市場を開きました。TaqポリメラーゼはT.aquaticus細胞から精製され、その後、T.aquaticusゲノムからpol遺伝子がクローニングされ、E. coli細胞で成功裏に発現されました。商業的には、天然のTaqポリメラーゼはAmpliTaq DNAポリメラーゼと呼ばれる組換えTaqポリメラーゼに置き換えられました。E. coli細胞で生成される組換えTaqポリメラーゼの量は、GC含量が高い（70%）T. aquaticus遺伝子の発現が低いため非常に少なかったです。その後、Taqポリメラーゼの生産を10倍以上改善するために最適化されました。Taqポリメラーゼを使用した大量のPCRデータが蓄積され、新しいPCR修飾用製品の開発に貴重な資源を提供しています。

熱安定性DNAポリメラーゼのタンパク質工学

Taqポリメラーゼは、実用的なジデオキシ配列決定に使用できるファミリーA酵素です。しかし、Taqポリメラーゼの配列決定データの出力は、T7 DNAポリメラーゼ（Sequenase）からの結果と比較して理想的ではありませんでした。巧妙なタンパク質工学戦略を使用して、科学者たちは野生型Taqポリメラーゼよりもジデオキシ配列決定により適した変異体Taqポリメラーゼに到達しました。

E. coliPolIとTaqポリメラーゼは、DNA鎖に組み込む基質としてデオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレオチドを識別します。T7 DNAポリメラーゼはデオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレオチドを同等に組み込み、非常に明確な信号を得やすくします。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠くT7 DNAポリメラーゼが商業製品として開発され、Sequenaseと名付けられました。

「ドメインタグ付け」戦略は、改良されたDNAポリメラーゼを成功裏に生成できます。例えば、Methanopyrus kandleriトポイソメラーゼVのヘリックス-ヘアピン-ヘリックス（HhH）ドメインをTaqポリメラーゼとPfuポリメラーゼの触媒ドメインにリンクさせることで新しいDNAポリメラーゼが生成されます。HhHは配列非特異的なDNA結合に作用します。これらのハイブリッド酵素は、熱安定性の向上や、塩や血液、フェノール、DNAインターカレーティング染料などの阻害物質に対する強い耐性などの改良された特性を持っています。タグ付け戦略のもう一つの成功例は、商業製品「Phusion DNAポリメラーゼ」の創出です。これは、Pfu DNAポリメラーゼとS. solfataricusからのDNA結合タンパク質Sso7dの融合タンパク質です。Pfu DNAポリメラーゼと比較して、この酵素は高い忠実度を維持しながら比較的高い延長速度を持っています。この酵素は非常に高いプロセシビティと正確なPCR性能を示し、広く使用されています。

図2. ファミリーB DNAポリメラーゼを使用したプロセシブPCRの概略図 (Ishino, S.; Ishino, Y. 2014)