DNAポリメラーゼ

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序論

DNAポリメラーゼは、生体内に普遍的に存在し、細胞内のDNAを鋳型として相補的DNA鎖を合成する酵素である。各生物種から多数の酵素が同定されており、これら酵素に共通する機能を解明するための研究が数多く行われてきた。DNAポリメラーゼは、複製および修復におけるゲノム完全性の維持に関与するだけでなく、DNAクローニング、シーケンシング、標識、変異導入など、in vitroにおけるDNA操作においても重要な役割を果たす。デオキシリボヌクレオチド鎖を合成する能力は保存されている一方で、プロセシビティ、忠実度（合成精度）、および基質ヌクレオチド選択性は酵素間で大きく異なる。各DNAポリメラーゼが有する相違点や固有の特性を活用することは、独自性の高い試薬開発に資するため、新規DNAポリメラーゼの探索は本分野における主要な研究テーマの一つとなっている。近年では、タンパク質工学的手法により、DNA操作の特定目的に最適化された高性能DNAポリメラーゼが多数開発されている。なかでも耐熱性DNAポリメラーゼは、分子生物学におけるPCR関連技術において特に重要である。

図1. 生命の三ドメインにおけるDNAポリメラーゼの分布（Ishino, S.; Ishino, Y. 2014）

黎明期：Taqポリメラーゼ

最も代表的な耐熱性DNAポリメラーゼは、Thermus aquaticus由来のDNAポリメラーゼI、すなわちTaqポリメラーゼである。Taqポリメラーゼは、米国モンタナ州イエローストーン国立公園で分離されたT. aquaticusから同定され、Chienらにより報告されたが、この酵素がこれほど著名になることを予見した者はいなかった。Escherichia coli由来DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントを用いたPCR（polymerase chain reaction）技術は1985年に報告された。二本鎖DNAを一本鎖DNAへ変性させる工程において失活しない耐熱性DNAポリメラーゼは、PCR法を幅広い実用技術へと発展させる上で決定的な役割を果たした。その後、Taqポリメラーゼを用いた簡便かつ信頼性の高いPCR法が考案された。Taqポリメラーゼは優れた耐熱安定性を有するため、DNAポリメラーゼを含む反応混合液を調製した後は、反応チューブをインキュベーター内に保持したまま、実験中は温度を変更するだけでよいという利点があった。

反応温度を迅速に切り替え可能なPCRキットおよび装置の登場により、PCR市場が拡大した。Taqポリメラーゼは当初T. aquaticus細胞から精製され、その後、T. aquaticusゲノムからpol遺伝子がクローニングされ、E. coli細胞での発現に成功した。商業的には、天然型Taqポリメラーゼは、AmpliTaq DNAポリメラーゼと呼ばれる組換えTaqポリメラーゼに置き換えられた。T. aquaticus遺伝子はGC含量が高い（70%）ため発現量が低く、E. coli細胞での組換えTaqポリメラーゼ生産量は非常に少なかったが、その後の最適化により生産性は10倍以上改善された。Taqポリメラーゼを用いたPCRデータは大量に蓄積されており、PCR改変に関する新規製品開発にとって貴重なリソースとなっている。

耐熱性DNAポリメラーゼのタンパク質工学

TaqポリメラーゼはファミリーAに属し、実用的なジデオキシ法シーケンシングに利用可能である。しかし、Taqポリメラーゼによるシーケンシングデータの出力は、T7 DNAポリメラーゼ（Sequenase）による結果と比較して必ずしも理想的ではなかった。巧妙なタンパク質工学戦略により、野生型Taqポリメラーゼよりもジデオキシ法シーケンシングに適した変異Taqポリメラーゼが創出された。

E. coli PolIおよびTaqポリメラーゼは、DNA鎖への取り込み基質としてデオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレオチドを識別する。一方、T7 DNAポリメラーゼはデオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレオチドを同程度に取り込むため、非常に明瞭なシグナルが得やすい。3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたT7 DNAポリメラーゼが、Sequenaseとして商用製品化された。

「ドメイン・タギング（domain tagging）」戦略は、改良型DNAポリメラーゼの創製に有効である。例えば、Methanopyrus kandleri由来トポイソメラーゼVのヘリックス‐ヘアピン‐ヘリックス（HhH）ドメインを、TaqポリメラーゼおよびPfuポリメラーゼの触媒ドメインに連結することで新規DNAポリメラーゼが作製されている。HhHは配列非特異的なDNA結合に関与する。これらのハイブリッド酵素は、耐熱安定性の向上に加え、塩類や、血液、フェノール、DNAインターカレーター色素などの阻害因子に対する高い耐性といった改良特性を示す。タギング戦略の別の成功例として、商用製品「Phusion DNA Polymerase」が挙げられる。これは、Pfu DNAポリメラーゼと、S. solfataricus由来DNA結合タンパク質Sso7dとの融合タンパク質である。本酵素は、Pfu DNAポリメラーゼと比較して高忠実度を維持しつつ、相対的に高い伸長速度を示す。非常に高いプロセシビティと高精度なPCR性能を有するため、広く使用されている。

図2. ファミリーB DNAポリメラーゼを用いたプロセシブPCRの模式図（Ishino, S.; Ishino, Y. 2014）