DERA

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はじめに

2-デオキシ-d-リボース-5-リン酸アルドラーゼ（DERA）は、アセトアルデヒドとグリセラルデヒド-3-リン酸（G3P）の可逆的なアルドール反応を触媒し、2-デオキシリボース-5-リン酸（DR5P）を形成します。この酵素は、ケトンの代わりにアルデヒドを自然な供与体として使用するアルドラーゼの中で特別です。知られているすべてのDERAは、クラスIメカニズムに従って機能します。DERAは、最大4炭素の長鎖を持つ多くのアルデヒドを受け入れ、G3Pにおいて（S）-構成の立体中心を生成することができます。DERAのもう一つの興味深い特徴は、2,4,6-トリデオキシヘキソースを生成するための連続アルドール反応を触媒できることです。これらは、アトルバスタチンやコレステロール低下薬の貴重な中間体として使用される可能性があります。アセトアルデヒドとクロロアセトアルデヒドの2分子の連続添加が、基質ではなく酵素によって制御される高い立体特異的ポリオール系をもたらすことがわかりました。この連続アルドール反応は熱力学的に制御されており、安定した分子内ヘミアセタールが形成されると停止します。

図1. DERAによって触媒されるin vivo 2-deoxy-D-ribose-5-phosphate反応 (Haridas, M.; et al. 2018)

DERAはdeoC遺伝子によってコードされています。DERA_ECの配列は、1982年にE. coli株K-12から酵素が単離された際に初めて報告されました。この酵素は259のアミノ酸から構成され、分子量は27.7 kDaです。S. typhimuriumから単離された酵素のアミノ酸組成は長い間報告されています。近年、DERAはさまざまな植物および動物組織で同定され、これらの組織は複数のパラメータに基づいて特徴付けられています。ヒトでは、肺および肝細胞で最も発現し、これらの細胞におけるストレス誘発損傷を遅延または最小化することによってストレス応答に関与しています。

DERA_ECのX線構造は、酵素が一般的なTIM（α/β）₈-バレルフォールドであることを示しています。構造解析によると、酵素は二量体として存在します。異なる生物からのDERAの結晶構造を比較した結果、水分子がすべての結晶構造で保存されていることがわかり、触媒メカニズムにおけるその重要性を示しています。古細菌Aeropyrum pernixから単離された酵素の構造研究は、そのモノマー構造がDERA_ECのそれに非常に似ていることを示していますが、安定したテトラマー構造で存在します。テトラマー形態は、タンパク質の熱安定性を向上させる上で重要な役割を果たしますが、触媒活性には影響を与えません。

その後の結晶学的研究では、カルビノールアミン中間体と、位置201（Lys）における2番目のリジン残基がLys167に非常に近いことが特定されました。続く研究では、Lys167とLys201がDERAの触媒活性に重要であり、Lys167はシッフ塩基の形成に直接関与し、Lys201はLys167のpKaの撹乱に関与している可能性があることが示されました。

図2. 二次元図は活性部位の接触を示す (Haridas, M.; et al. 2018)

DERAのアセトアルデヒド耐性

Jennerwein et al.は、高スループットスクリーニングと指向進化戦略を組み合わせて、DERAの触媒活性およびクロロアセトアルデヒド耐性に正の影響を与える変異を特定しました。彼らは、アミノ酸残基Phe200、Ile166、Met185によって形成される疎水性クラスターがDERAの活性部位であるLys167およびLys201に非常に近いことを発見しました。DERA_ECにおける成功したポイント変異を組み合わせることで、彼らは産業関連条件下で（3R,5S)-6-クロロ-2,4,6-トリデオキシヘキサピラノシドの10倍改善された変異体を得ました。

科学者たちは、しばしば仮想変異および部位特異的変異導入を使用して、タンパク質構造の剛性に影響を与えます。位置120、174、および213で変異した変異体も耐性が向上しますが、初期活性は50％低下します。Dick et al.は、2つのアセトアルデヒド分子間のアルドール縮合生成物をDERAの阻害剤として特定しました。触媒残基Lys167を交換することは、酵素の機能を失うことなくほぼ不可能です。したがって、システインをメチオニンのような非核酸性アミノ酸に置き換えることが、アセトアルデヒド耐性酵素の生成に最適な選択肢と考えられています。Cys47Met変異体は、これまでに報告された中で最もアルデヒド耐性のあるDERA_EC変異体です。

図3. E. coli DERAの結晶構造 (Haridas, M.; et al. 2018)