DERA

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序論

2-デオキシ-D-リボース-5-リン酸アルドラーゼ（DERA）は、アセトアルデヒドとグリセルアルデヒド-3-リン酸（G3P）との可逆的アルドール反応を触媒し、2-デオキシリボース-5-リン酸（DR5P）を生成する。本酵素は、天然ドナーとしてケトンではなくアルデヒドを利用する点で、アルドラーゼの中でも特異的である。既知のDERAはいずれもクラスI機構に従って作用する。DERAは炭素数4までの長鎖アルデヒドを幅広く受容し、G3Pにおいて（S）配置の不斉中心を生成できる。DERAのもう一つの興味深い特性として、連続アルドール反応を触媒して2,4,6-トリデオキシヘキソースを生成できる点が挙げられ、これはアトルバスタチンおよびコレステロール低下薬の有用な中間体として利用可能である。アセトアルデヒド2分子およびクロロアセトアルデヒドの逐次付加により、高度に立体特異的なポリオール系が得られ、この場合の立体選択性は基質ではなく酵素によって制御されることが見出されている。この連続アルドール反応は熱力学的支配下にあり、安定な分子内ヘミアセタールが形成されると反応は停止する。 

図1．DERAが触媒するin vivoにおける2-デオキシ-D-リボース-5-リン酸反応（Haridas, M.; et al. 2018）

DERAはdeoC遺伝子にコードされている。DERA_ECの配列は、E. coli K-12株から酵素が単離された1982年に初めて報告された。本酵素は259アミノ酸からなり、分子量は27.7 kDaである。S. typhimurium由来として単離された酵素のアミノ酸組成は、以前から報告されている。近年、DERAは多様な植物および動物組織において同定され、複数のパラメータに基づきこれら組織での特性評価が行われている。ヒトでは肺および肝細胞での発現が最も高く、これら細胞におけるストレス誘導性損傷を遅延または最小化することにより、ストレス応答に関与する。

DERA_ECのX線構造は、本酵素が典型的なTIM（α/β）₈バレルフォールドを有することを示している。構造解析によれば、本酵素は二量体として存在する。異なる生物由来DERAの結晶構造を比較した結果、水分子がすべての結晶構造で保存されていることが見出され、触媒機構における重要性が示唆される。古細菌Aeropyrum pernix由来として単離された酵素の構造研究では、単量体構造はDERA_ECと非常に類似する一方で、安定な四量体構造として存在することが示されている。四量体形成はタンパク質の熱安定性向上に重要な役割を果たすが、触媒活性には影響しない。

その後の結晶学的研究により、カルビノールアミン中間体および201位の第2のリジン残基（Lys）が同定され、これはLys167に極めて近接している。続く研究から、Lys167およびLys201がDERAの触媒活性に必須であり、Lys167はシッフ塩基形成に直接関与し、Lys201はLys167のpKaの変動に関与する可能性が示されている。

図2．活性部位の相互作用を示す二次元図（Haridas, M.; et al. 2018）

DERAのアセトアルデヒド耐性

Jennerwein et al.は、ハイスループットスクリーニングと指向性進化戦略を組み合わせ、DERAの触媒活性およびクロロアセトアルデヒド耐性に正の影響を与える変異を同定した。彼らは、アミノ酸残基Phe200、Ile166、Met185により形成される疎水性クラスターが、DERAの活性部位であるLys167およびLys201に非常に近接していることを見出した。DERA_ECにおける有効な点変異を組み合わせることで、工業的に関連する条件下において（3R,5S)-6-クロロ-2,4,6-トリデオキシヘキサピラノシドの生成能が10倍に改善した変異体を得た。

研究者はしばしば、仮想変異導入および部位特異的変異導入によりタンパク質構造の剛性に影響を与える。120位、174位、213位に変異を導入した変異体も耐性の増強を示すが、初期活性は50%低下する。Dick et al.は、アセトアルデヒド2分子間のアルドール縮合生成物がDERA阻害剤であることを同定した。触媒残基Lys167を機能喪失なしに置換することはほぼ不可能である。したがって、システインをメチオニンのような非求核性アミノ酸に置換することが、アセトアルデヒド耐性酵素の創製における最適な選択肢と考えられている。Cys47Met変異体は、現在までに報告されているDERA_EC変異体の中で最もアルデヒド耐性が高い。

図3．E. coli DERAの結晶構造（Haridas, M.; et al. 2018）