DAAO

D-アミノ酸オキシダーゼ（DAAO、EC 1.4.3.3）は、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を補欠分子族とする代表的なフラボタンパク質酵素である。本酵素は高い立体選択性と広い基質特異性を有し、D-アミノ酸の定性・定量分析、バイオセンサー、L-アミノ酸およびα-ケト酸の製造などに広く利用できる。しかし、DAAOのより重要な価値は、7-アミノセファロスポラン酸（7-ACA）製造における二段階プロセスへの応用にある。すなわち、DAAOによりセファロスポリンCを酸化してグルタリル-7-アミノセファロスポラン酸（GL-7-ACA）を生成し、続いてGL-7-ACAアシラーゼにより脱アシル化して7-ACAを得る。近年、セファロスポリンC（CPC）から7-ACAをバイオ触媒的に製造する二段階酵素変換は、ますます注目を集めている。

分布

DAAOは、ヒト、ラット、ウサギ、ブタなど哺乳類の肝臓、脳、腎臓組織に広く存在する。また、藻類、Neurospora、Aspergillus、細菌、Trichoderma morphicum、Saccharomyces cerevisiae、Rhodotorula glutin などの微生物にも広く分布する。由来の異なるDAAOの配列解析から、相互に一定の相同性が認められることが示されている。近縁種ほど相同性は高い一方で、生化学的特性には顕著な差異が存在する。

例えば、哺乳類由来DAAOの補欠分子族FADへの結合は比較的緩く、補欠分子族が脱離しやすいため、DAAOは活性を失いやすい。基質利用の観点では、動物由来DAAOによるセファロスポリンCの酸化的脱アミノ化活性は相対的に低いのに対し、一部の酵母が産生するDAAOはFADへの結合が強固で、CPC側鎖に対する触媒活性が高い。

生理機能

微生物、特に酵母は、DAAOを利用してD-アミノ酸を資化し増殖することができる。さらに、D-アミノ酸は細菌細胞壁の形成においても重要な役割を担う。D-アミノ酸はペプチドグリカンおよびムラミン酸の構成要素であるが、動物におけるD-アミノ酸産生に関する研究は限られており、その多くは脊椎動物に集中している。したがって、高等動物におけるDAAOの生理学的役割は未だ明確ではない。D'Aniello et al. は、一部の動物では体内のDAAOおよびD-アスパラギン酸オキシダーゼ（DAS-PO）が外因性D-アミノ酸を代謝する一方、内因性D-アミノ酸に対する解毒機構としても機能し得ると考えている。近年の研究により、D-アミノ酸が脳内の神経伝達に関与することが確認されており、DAAOは脳内D-アミノ酸量の制御に関与するとされる。

生物学的特性

1973年、ブタ腎臓由来D-アミノ酸オキシダーゼ（pKDAAO）が、最初に精製されたフラボタンパク質として報告された。pKDAAOの相補DNA（cDNA）は完全にクローニングされ、塩基配列が決定されている。pKDAAOは、347アミノ酸をコードする1041塩基対のオープンリーディングフレームを含む。1987年には、Rhodotorula chinensis から精製D-アミノ酸オキシダーゼ（RgDAAO）が得られ、これは微生物由来フラボタンパク質として初の精製例でもあった。RgDAAOのcDNAはPCRによりクローニングされ、さらに大腸菌（E. coli）においてホロ酵素の発現も行われた。1998年にはRgDAAOのゲノム配列が決定され、タンパク質コード領域全体は1104塩基対からなり、5つのイントロンを含むことが確認された。続いて、Trigonopsos variabilis 由来D-アミノ酸オキシダーゼ（TvDAAO）も単離された。遺伝子がクローニングされ、ホロ酵素は356アミノ酸からなり、TvDAAOゲノム中に1つのイントロンを含むことが明らかとなった。

触媒機構

DAAOはD-アミノ酸のアミノ基を酸化し、対応するケト酸とアンモニアを生成する。本反応はFADの関与を必須とする。反応過程は以下の3段階に分けられる。

(1) RCHNH₂COOH + E-FAD → RC=NHCOOH + E-FADH₂
(2) E-FADH₂ + O₂ → E-FAD + H₂O₂
(3) RC=NHCOOH + H₂O → RCOCOOH + NH₃

反応(1)は不完全還元反応であり、D-アミノ酸が脱水素されて対応するイミノ酸となり、還元型FADに結合する。この段階が全反応における唯一の酵素反応である。反応(2)では、還元型FADが分子状酸素の存在下で再酸化され、酸素は過酸化水素へと変換される。反応(3)では、イミノ酸が酵素非依存的に加水分解され、α-ケト酸とアンモニアが生成する。ただし、生体内に過酸化水素が存在する場合、α-ケト酸は脱炭酸を受け、対応する酸を生成する。

応用

現在、DAAOは主として7-アミノセファロスポラン酸の二段階酵素法製造に用いられている。二段階酵素反応によるCPCから7-ACAへの変換は以下のとおりである。第1段階では、好気条件下でDAAOがCPC分子中のD-アミノアジポイル側鎖の酸化的脱アミノ化を触媒し、α-ケト酸-アジポイル-7-アミノセファロスポラン酸（AKA-7-ACA）、NH₃およびH₂O₂を生成する。生成したH₂O₂はさらにAKA-7-ACAを酸化的脱炭酸し、グルタリル-7-アミノセファロスポラン酸（GL-7-ACA）へと変換する。次いで、GL-7-ACAのグルタリル側鎖がGL-7-ACAアシラーゼの作用により加水分解され、二段階反応の最終産物である7-ACAが得られる。分子生物学的手法によりDAAO遺伝子はクローニングおよび発現され、工業生産に利用されている。さらに、D-アミノ酸の解毒用途として食品産業への応用も期待されている。