DAAO

D-アミノ酸オキシダーゼ（DAAO、EC 1.4.3.3）は、フラビンアデニン（FDA）に基づく典型的なプロテアーゼです。この酵素は高い立体異性体選択性と広範な触媒基質のスペクトルを持ち、D-アミノ酸の定性および定量分析、バイオセンサー、L-アミノ酸およびα-ケト酸の生産に広く使用されます。しかし、DAAOのより重要な価値は、7-アミノセファロスポラン酸（7-ACA）の生産のための二段階プロセスの応用です。セファロスポリンCをD-アミノ酸オキシダーゼ（DAAO）で酸化してグルタリル-7-アミノセファロスポラン酸（GL-7-ACA）を生成し、その後GL-7-ACAアシラーゼによる脱アセチル化を経て7-ACAを生成します。近年、セファロスポリン（CPC）の二段階酵素変換による7-ACAの生産が注目を集めています。

分布

DAAOは、人間、ラット、ウサギ、豚などの哺乳類の肝臓、脳、腎臓組織に広く存在します。DAAOはまた、藻類、Neurospora、Aspergillus、細菌、Trichoderma morphicum、Saccharomyces cerevisiae、Rhodotorula glutinなどの微生物にも広く存在します。異なる供給源からのD-アミノ酸オキシダーゼの配列解析は、彼らの間に一定の相同性があることを示しています。種が近いほど相同性は高くなりますが、生化学的特性には顕著な違いがあります。

例えば、哺乳類のD-アミノ酸オキシダーゼと補因子FADとの結合は緩く、補因子は容易に失われ、DAAOはその活性を失います。基質利用の観点から、動物由来のDAAOによるセファロスポリンCの酸化脱アミノ化活性は比較的低い一方で、一部の酵母によって生成されるDAAOはFADとの強い結合を持ち、CPC側鎖に対して高い触媒活性を示します。

生理的機能

微生物、特に酵母はD-アミノ酸オキシダーゼを用いて成長することができます。さらに、D-アミノ酸は細菌の細胞壁形成においても重要な役割を果たします。彼らはペプチドグリカンやムラミン酸の構成要素ですが、動物におけるD-アミノ酸の生産に関する研究は少なく、ほとんどが脊椎動物に集中しています。したがって、高等動物におけるDAAOの生理的役割はまだ明らかではありません。D'Aniello et al.は、いくつかの動物において、体内のDAAOとD-アスパラギン酸オキシダーゼ（DAS-PO）が外因性D-アミノ酸を代謝し、内因性D-アミノ酸に対する解毒剤として機能する可能性があると考えています。最近の研究では、D-アミノ酸が脳内の神経伝導に役割を果たし、DAAOが脳内のD-アミノ酸の含量を制御する責任があることが確認されています。

生物学的特性

1973年、豚腎D-アミノ酸オキシダーゼ（pKDAAO）が最初に精製されたフラビンタンパク質として抽出されました。pKDAAOの補完的DNA（cDNA）は完全にクローニングされ、配列決定されています。pKDAAOは347アミノ酸の酵素をコードする1041塩基対のオープンリーディングフレームを含んでいます。1987年にRhodotorula chinensisから精製されたD-アミノ酸オキシダーゼ（RgDAAO）は、微生物からのフラビンタンパク質の最初の精製でもありました。RgDAAOのcDNAはPCRによってクローニングされ、ホロ酵素もE. coliで生成されました。1998年にRgDAAOのゲノムが配列決定され、全タンパク質コーディング領域は1104塩基対を含み、5つのイントロンを含むことが確認されました。その後、Trigonopsos variabilis D-アミノ酸オキシダーゼ（TvDAAO）も分離されました。この遺伝子はクローニングされ、ホロ酵素は356アミノ酸を含み、TvDAAOのゲノムにイントロンが含まれていることがわかりました。

触媒メカニズム

D-アミノ酸オキシダーゼはD-アミノ酸のアミノ基を酸化して対応するケト酸とアンモニアを形成します。この反応はFADの参加が必要です。反応プロセスは三つのステップに分かれます。

(1) RCHNH₂COOH + E-FAD → RC=NHCOOH + E-FADH₂
(2) E-FADH₂ + O₂ → E-FAD + H₂O₂
(3) RC=NHCOOH + H₂O → RCOCOOH + NH₃

反応(1)は不完全還元反応であり、D-アミノ酸は対応するイミノ酸に脱酸素化され、還元FADに結合します。このステップは全反応の中で唯一の酵素反応です。反応(2)では、還元FADが分子酸素の存在下で再び酸化され、酸素が過酸化水素に変換されます。反応(3)では、イミノ酸が酵素なしでα-ケト酸とアンモニアに加水分解されます。しかし、体内に過酸化水素が存在する場合、α-ケト酸の脱炭酸が起こり、対応する酸が生成されます。

応用

現在、D-アミノ酸オキシダーゼは主に7-アミノセファロスポラン酸の二段階酵素生産に使用されています。CPCを7-ACAに変換する二段階酵素反応は次のようになります：第一段階では、D-アミノ酸オキシダーゼが好気的条件下でCPC分子内のD-アミノアジピン酸側鎖の酸化脱アミノ化反応を触媒し、α-ケト酸-アジピン酸-7-アミノセファロスポラン酸（AKA-7-ACA）、NH₃およびH₂O₂を生成します。生成されたH₂O₂は、さらにAKA-7-ACAを酸化的脱炭酸してグルタリル-7-アミノセファロスポラン酸（GL-7-ACA）を生成します。次に、GL-7-ACAのグルタリル側鎖はGL-7-ACAアシラーゼの作用によって加水分解され、二段階反応の最終生成物である7-ACAが形成されます。分子生物学的手法を用いてDAAO遺伝子がクローニングされ、発現され、工業生産に使用されました。D-アミノ酸の解毒剤として、食品産業での利用が期待されています。