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要約

酵素的縮合反応の立体化学的性質は、アセチル-CoAのアセチル基がオキサロ酢酸のケト部分のsi面にメチル基の反転と共に追加されることです。

全体の反応は三つの化学反応に細分化できます：(a) アセチル部分からのyプロトン抽出によるアセチル-CoAのチオエステル基のエノール化；(b) エノラートアニオンとオキサロ酢酸のカルボキシル基との縮合によるシトリルチオエステルの形成；(c) シトリルチオエステルが加水分解されてシトレートとコエンザイムAが形成されます。全体の反応は、活性部位あたり約6000 mol s^-1の回転数と、pH 7.2での8380リットル mol^-1の見かけの平衡定数を持っています。オキサロ酢酸が最初に結合し、アセチル-CoAの結合定数は少なくとも20倍増加します。アセチル-CoAが最初に結合することを許可すると、オキサロ酢酸の結合速度は低下します。シトレートシンターゼ（CS）は非常に特異的で、オキサロ酢酸とアセチル-CoAが生理的基質であるときのみ縮合反応を行います。ライアー反応（縮合反応の逆）では、シトルリン-CoAのシトルリン部分のみが切断されます。この酵素によって加水分解されることができるのは、シトリルまたはマリル-CoAのみです。豚の心臓とE. coliから得られた配列から、豚の心臓酵素は437アミノ酸からなる二つの同一のサブユニットで構成され、分子量は48,969であることが知られています。各サブユニットにはオキサロ酢酸とアセチル-CoAの結合部位を含む活性部位があり、これらの活性部位は機能的に互いに独立しているようです。    

分子構造

以下の酵素-リガンド複合体を含む三つの結晶形（空間群 P 4₁2₁2, C2 および P 4₃2₁2）の構造が決定されました：

オキサロ酢酸とS-アセトニルコエンザイムAを含む結晶を除くすべての結晶形における二量体分子は、正確な二重対称性関係に従います。オキサロ酢酸結合結晶では、二量体は非対称単位であり、サブユニットは局所的な二重対称に関連しています。シトレートシンターゼの構造は三つの結晶形の間で大きく異なります。この分子は一つの「開いた」構造と二つの「閉じた」構造を持っています。二つの閉じた構造は表面上は似ていますが、内部の側鎖の詰まり方はやや異なります。

図 1. (a) シトレートシンターゼの開いた形の二量体の空間充填表現。 (b) 二つの閉じた形の二量体の空間充填表現。視点は二重軸に沿っています (Wiegand, G.; Remington, S.J. 1986)

シトレート/オキサロ酢酸結合部位

活性部位はサブユニットの二つのドメインの間の裂け目に存在します。シトレートまたはオキサロ酢酸とコエンザイムAの結合部位は、酵素の閉じた形で観察されます。C2結晶形では、シトレートは大きなドメインと小さなドメインの間の裂け目の奥深くに結合し、コエンザイムAの存在により溶媒から完全にアクセスできません。シトレート分子は三つのヒスチジン残基（His 174、His 238、His 320）と三つのアルギニン残基（Arg 329、Arg 401、Arg 421、他のサブユニットから）に水素結合または塩橋を形成しています。活性部位は主に極性ですが、非極性の相互作用がシトレートシンターゼの極端な基質特異性を決定するのに役立ち、例えば、Phe 397がシトレート分子との異常なエッジオン相互作用を形成することで、構造変化の引き金となる可能性があります。活性部位はシトレートと同様にオキサロ酢酸を収容できます。ヘリックスKとLの軸は、逆の極性を持つ結合したシトレートに向かっており、したがってそれらの電場がシトレートの結合と極性に寄与する可能性があります。

図 2. モノクリニックモデルにおけるシトレート結合部位の立体描画 (Wiegand, G.; Remington, S.J. 1986)

1. citrate synthase from pig heart muscle with no ligands,
2. citrate synthase from pig heart muscle with no ligands,
3. pig heart citrate synthase with bound citrate and Coenzyme A,
4. pig heart citrate synthase with bound oxaloacetate and S-acetonyl Coenzyme A,
5. chicken heart muscle citrate synthase with bound citrate and Coenzyme A, and
6. chicken heart citrate synthase with bound (3R, S)-3, 4 dicarboxy-3-hydroxybutyl-Coenzyme A (a citryl-Coenzyme A analog).