コリンオキシダーゼ

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序論

コリンオキシダーゼ（コリン‐酸素 1‐酸化還元酵素）は、フラビンを介した4電子・2段階の酸化反応により、コリンをグリシンベタインへと酸化する反応を触媒する。第1段階では、コリンがベタインアルデヒドへ酸化され、同時に分子状酸素が過酸化水素へ還元される。第2段階では、ベタインアルデヒドが水和してgem‐ジオール‐コリンを生成し、これがグリシンベタインへ酸化され、酸素は過酸化水素へ還元される。本酵素は、窒素マスタードが酵素および組織代謝に及ぼす影響の研究過程において、1948年にラット肝臓から初めて単離された。その後、1977年にIkuta et al.が、Arthrobacter globiformis由来の精製コリンオキシダーゼをin vitroで初めて同定した。コリンオキシダーゼの反応産物であるグリシンベタインは、細胞が高浸透圧に適応するために利用する、生体適合性溶質の限られた一群の一つである。細胞質内に大量のグリシンベタインを蓄積することは微生物にとって必須であり、これにより細胞内水分量を制御できる。高塩環境下でグリシンベタインを蓄積できない場合、脱水、浸透圧ショック、および原形質分離を引き起こす。E. coli O157:H7、Staphylococcus属、Enterococcus faecalis、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniaeを含む多くのヒト病原体は、ヒト感染部位で遭遇する高浸透圧に補償するため、グリシンベタインを蓄積する。

グリシンベタインはヒト腎臓における重要なオスモプロテクタントであり、メチオニン生合成におけるメチル供与体としても利用される。ヒトにおいてコリンは、リポタンパク質およびリン脂質の生合成、遺伝子発現の制御など、複数の経路に関与し得る。ヒトコリンデヒドロゲナーゼは、心血管疾患、乳がん、男性不妊、ホモシスチン尿症、メタボリックシンドローム等を含む多様な病態と密接に関連している。

図1．コリンオキシダーゼにより触媒される、フラビン介在の2段階反応によるコリンからグリシンベタインへの酸化（Gadda, G. 2020）

酵素構造

サイズ排除クロマトグラフィーおよび非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果から、溶液中のコリンオキシダーゼは濃度非依存的な二量体として存在し、分子量は120 kDaであることが確認された。野生型酵素の結晶構造、グリシンベタイン結合体および活性部位キャビティにDMSOが結合した結晶構造、活性部位変異体S101Aの酢酸との複合体結晶構造、ならびにリガンド非結合のV464Aの結晶構造など、複数の結晶構造解析により、いずれも本酵素が二量体であることが確認されている。二量体界面は、界面端部において反対電荷を有する残基間の、同一のサブユニット間接触6組×2セットから構成される（図2）。

図2．分解能1.86Åまで精密化されたコリンオキシダーゼの三次元構造（Protein Data Bank 2jbv）（Gadda, G. 2020）

二量体界面の中央部には、基質の進入および生成物の出入りを可能にするゲートとして機能する非極性残基群が含まれる。コリンオキシダーゼ各サブユニットのフォールディング様式は、他のグルコース‐メタノール‐コリン酸化還元酵素と類似しており、PHBHフォールドを有する。本酵素は、FAD結合ドメイン（残基1–159、201–311、464–527から構成）と、基質結合ドメイン（残基160–200および312–463から構成）を有する。フラビンはタンパク質内部に強固に埋め込まれており、C8メチルを介してH99のNε2原子と共有結合している。基質結合ドメインでは、活性部位底部は歪んだ6本鎖の逆平行βシートにより形成され、反対側にはバルク溶媒へ突出する3本のαヘリックスが存在する。活性部位キャビティには両ドメイン由来の残基が含まれ、基質結合ドメイン側のE312、W331、H351、F357、およびFAD結合ドメイン側のW61、S101、W331、V464、H466、N510が関与する（図3）。

図3．反応生成物グリシンベタインが結合した野生型コリンオキシダーゼの活性部位（Gadda, G. 2020）

基質結合

コリンオキシダーゼの活性部位キャビティは溶媒から遮蔽されており、FADのre面に隣接している。キャビティ体積は約125 ųであり、コリン分子（約95 ų）およびH₂O分子（約30 ų）を収容するのに十分である。フラビンから離れたキャビティ領域は疎水性残基（例：W61、W331、F357、V464）により囲まれている。唯一の負電荷残基であるE312のカルボキシル側鎖は、コリンのトリメチルアンモニウム頭部とのイオン相互作用を介して、基質結合に約15 kJ/mol寄与する。X線結晶構造解析および変異導入研究により、FADのイソアロキサジン部位近傍で活性部位キャビティを縁取る3つの極性残基、すなわちH351、H466、N510は、コリンのヒドロキシル基との水素結合相互作用または立体効果により、基質結合への側鎖寄与が比較的小さいことが示されている。

図4．コリンオキシダーゼ活性部位への入口（Gadda, G. 2020）