コリンオキシダーゼ

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はじめに

コリンオキシダーゼ（コリン-酸素 1-オキシドレダクターゼ）は、コリンをグリシンベタインに酸化する四電子、二段階のフラビン媒介反応を触媒します。最初のステップでは、コリンがベタインアルデヒドに酸化され、その後、分子酸素が過酸化水素に還元されます。第二のステップでは、ベタインアルデヒドが水和されてgem-ジオール-コリンが生成され、これがグリシンベタインに酸化され、酸素は過酸化水素に還元されます。この酵素は、1948年にラットの肝臓から初めて分離され、窒素マスタードが酵素や組織代謝に与える影響を研究していました。その後、1977年に生体外でArthrobacter globiformisから精製されたコリンオキシダーゼを最初に特定したのは生田らです。コリンオキシダーゼの生成物であるグリシンベタインは、高浸透圧に対抗するために細胞が使用する限られた数の生体適合性溶質の一つです。細胞質内に大量のグリシンベタインが蓄積されることは微生物にとって不可欠であり、細胞内の水分量を制御することができます。高塩環境でグリシンベタインを蓄積できないと、脱水、浸透圧ショック、プラズモリシスが発生します。E. coli O157:H7、Staphylococcus spp.、Enterococcus faecalis、Pseudomonas aeruginosa、およびKlebsiella pneumoniaeを含む多くの人間の病原体は、ヒト感染の部位で遭遇する高浸透圧を補うためにグリシンベタインを蓄積します。

グリシンベタインは人間の腎臓において重要なオスモプロテクタントであり、メチオニンの生合成におけるメチル供与体としても使用されます。人間において、コリンはリポタンパク質やリン脂質の生合成、遺伝子発現の調節など、さまざまな経路で役割を果たすことができます。ヒトコリンデヒドロゲナーゼは、心血管疾患、乳がん、男性不妊、ホモシステイン尿症、代謝症候群など、さまざまな病理と密接に関連していますなど。

図1. コリンオキシダーゼによって触媒されるコリンからグリシンベタインへの二段階のフラビン媒介酸化 (Gadda, G. 2020)

酵素の構造

サイズ排除クロマトグラフィーと非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果は、溶液中のコリンオキシダーゼが分子量120 kDaの濃度に依存しない二量体として存在することを確認しました。野生型酵素の結晶構造や、グリシンベタインが結合した状態、活性部位の空洞にDMSOが結合した状態、アセテートと複合体を形成した活性部位変異体S101Aの結晶構造、リガンドを欠くV464Aの結晶構造など、さまざまな結晶構造が酵素の二量体状態を確認しています。二量体インターフェースは、インターフェースの端で反対の電荷を持つ残基間の6つの同一の相互作用接触の2セットで構成されています（図2）。

図2. 解像度1.86Åに精製されたコリンオキシダーゼの三次元構造 (Protein Data Bank 2jbv) (Gadda, G. 2020)

二量体インターフェースの中央部分には、基質の侵入と生成物の出入りを許可するゲートとして機能する一連の非極性残基があります。コリンオキシダーゼの各サブユニットの折りたたみモードは、他のグルコース-メタノール-コリンオキシドレダクターゼと類似しており、PHBH折りたたみを持っています。酵素にはFAD結合ドメイン（残基1-159、201-311、464-527から構成）と基質結合ドメイン（残基160-200および312-463から構成）があります。フラビンはタンパク質にしっかりと埋め込まれており、C8メチルを介してH99Nε2原子に共有結合されています。基質結合ドメインでは、活性部位の底は歪んだ6本の逆平行βシートによって形成され、反対側には溶媒に突き出た3つのαヘリックスがあります。活性部位の空洞には、両方のドメインからの残基、基質結合ドメインのE312、W331、H351、F357、およびFAD結合ドメインのW61、S101、W331、V464、H466、N510が含まれています（図3）。

図3. 反応生成物グリシンベタインが結合した野生型コリンオキシダーゼの活性部位 (Gadda, G. 2020)

基質結合

コリンオキシダーゼの活性部位の空洞は溶媒から除外されており、FADのre面に隣接しています。空洞の体積は約125 ųで、コリン分子（約95 ų）とH₂O分子（約30 ų）を収容するのに十分です。フラビンから離れた空洞の部分は疎水性残基（例：W61、W331、F357、V464）に囲まれています。唯一の負に帯電した残基E312のカルボキシル側鎖は、コリンのトリメチルアンモニウムヘッドグループとのイオン相互作用を通じて基質の結合に約15 kJ/molを寄与します。X線結晶構造解析と変異体研究により、活性部位の空洞の近くにあるFADのイソアロキサジン部分に接する3つの極性残基、すなわちH351、H466、N510は、コリンのヒドロキシルとの水素結合相互作用や立体効果によって基質の結合に寄与する側鎖が少ないことが示されています。

図4. コリンオキシダーゼの活性部位への入口 (Gadda, G. 2020)