カスパーゼ9

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序論

哺乳類において最もよく記載されているアポトーシス経路は2つあり、受容体誘導性経路とミトコンドリア・ストレス誘導性経路である。これらはそれぞれ外因性（extrinsic）経路および内因性（intrinsic）経路とも呼ばれる。両アポトーシス経路はいずれもカスパーゼ・カスケードを利用する。アポトーシス経路は、一般にカスパーゼと総称される実行（executioner）プロテアーゼにより細胞構造の解体を実現する。カスパーゼは、アポトーシスのシグナル伝達における位置づけに応じて、開始（initiator）カスパーゼと実行（effector）カスパーゼに大別される。プロカスパーゼは当初、単鎖の不活性なチモーゲンとして合成され、活性化されると細胞死を促進する。プロカスパーゼ9はモノマーとして存在し、内因性アポトーシス経路の開始カスパーゼとして機能する。プロドメインが長く、そこにはカスパーゼ活性化ドメイン（CARD）モチーフが含まれており、これを介してカスパーゼ9が活性化され、その後細胞をアポトーシス小体へと分解する。カスパーゼ9は重要な機能として、死のシグナルを最初のプロテオリシス事象へ変換し、致死的な実行プロテアーゼの活性化を直接媒介し得る。上流事象の制御、特にカスパーゼ9の制御は、増殖性疾患および変性疾患に対する有望な治療標的となり得る。 

カスパーゼ9の構造と活性化

カスパーゼ9の長いプロドメインN末端に存在するCARDモチーフは、Apaf-1のCARDに選択的に結合し得る。これに続いて、プロドメインと、大小サブユニットから構成される触媒ドメインとを連結するリンカーループが存在する（図1B）。サブユニット間の長いリンカーループは、その長さおよび大小サブユニットを連結する機能により、切断を受けることなく可動性を有し、活性部位へアクセスし得ると考えられている。カスパーゼ9の二量体化は迅速な自己触媒的切断を引き起こし、カスパーゼ9（p35/p12）を生成する。

カスパーゼ9の活性化については、2つの仮説が提唱されている。1つは「誘導コンフォメーションモデル」であり、Apaf-1アポトソームが結合によりカスパーゼ9のコンフォメーションを変化させ、これがカスパーゼ9活性化に必須であるとするものである。カスパーゼ9とApaf-1のCARDドメイン間の1:1複合体の結晶構造は、カスパーゼ9活性化に不可欠な相補的界面を示している。もう1つは「誘導近接モデル」であり、アポトソームがカスパーゼ9の二量体化のための足場（プラットフォーム）を提供すると仮定する。カスパーゼ9は触媒活性を維持するために、アポトソームへの結合を保持する必要がある。近年の研究では、切断体と比較してプロカスパーゼ9の方がアポトソームに対する親和性が高いことが示されている。さらに、プロカスパーゼ9の自己プロセシングの目的はカスパーゼ9を活性化することではなく、アポトソーム活性の持続時間を調節する分子タイマーを開始することにあるとされる。これらの新知見は一定程度、相互に矛盾し議論の余地があるものの、カスパーゼ9の活性化および活性を制御する機構に関する理解の深化を促進している。

図1. ヒトカスパーゼ9の推定アミノ酸構造（Li, P.; et al. 2000）

誘導型カスパーゼ9自殺遺伝子とその応用

誘導型カスパーゼ9（iCasp9）は、適切に活性化されないCAR-T細胞を除去する機構を提供し、臨床試験により新規の自殺遺伝子として実証されている。最適化されたiCasp9分子は、薬剤結合ドメインFK506-F36Vを基盤とし、短いSer-Gly-Gly-Gly-Serリンカーを介してΔCaspase9（生理的CARDを欠失したカスパーゼ9）に連結されている。AP1903またはAP20187は二量体化化学誘導因子（CID）として作用し、iCasp9に結合してΔCaspase9の二量体化を活性化することで、下流のカスパーゼ・カスケードを作動させ、アポトーシスを誘導する。iCasp9セーフティスイッチは、半合致造血幹細胞移植（haplo-HSCT）において臨床的に検証されている。本システムの前臨床研究では、重症複合免疫不全（SCID）マウス—ヒト異種移植モデルが検討され、CID投与により循環血中のヒトGFP陽性T細胞の99%以上が3日以内に死滅した。別の研究では、このiCasp9に基づく条件付きセーフティスイッチが、マウスモデルにおいてT細胞を迅速に除去し、進行中の自己免疫攻撃を抑止し得ることを強く支持している。臨床試験では、幹細胞移植後に再発した急性白血病の被験者5例に対し、iCasp9発現ドナーT細胞の輸注が行われた。移植片対宿主病（GVHD）を発症した4例では、iCasp9自殺スイッチにより、CID単回投与後30分以内に改変T細胞の90%以上が除去され、再増殖は認められなかった。長期追跡（3.5年）では、iC9-T細胞輸注およびCID投与が、haplo-HSCT後の免疫再構築を有効に補助し、病原性感染の予防に寄与することが示された。総じて、iCasp9自殺遺伝子技術は、CAR-T細胞療法の安全性向上および臨床適用拡大において顕著な優位性を示している。    

図2. 活性化iCasp9により誘導される導入細胞のアポトーシス（Li, P.; et al. 2000）