ビリルビンオキシダーゼ

ビリルビンは直鎖状テトラピロール誘導体の一群であり、ヒト体内における鉄ポルフィリン化合物の代謝産物の一つである。ビリルビン産生が過剰となる場合、または肝細胞におけるビリルビンの取り込み・抱合・排泄が障害される場合、血中ビリルビン濃度が上昇し、高ビリルビン血症を来す。したがって、ビリルビンの臨床的測定は、肝胆道系疾患、溶血および関連疾患の検出において重要である。ビリルビンオキシダーゼは、ビリルビンを酸化してビリベルジンを生成する反応を触媒する、臨床検査で汎用されるツール酵素であり、血清ビリルビンおよび総ビリルビン値の測定に用いられる。非特異的な化学的方法に比べて肝疾患のモニタリング感度が高く、血清ビリルビン検査は黄疸の病態に関するより詳細な情報を提供する。

構造

ビリルビンオキシダーゼのホロ酵素は、タンパク質、二価銅イオンおよび糖鎖から構成される。タンパク質はシステインを含まず、リジンおよびメチオニン含量が低く、アスパラギン酸、グルタミン酸およびアラニン含量が高い17種類のアミノ酸からなる。ビリルビンオキシダーゼの前駆体は572残基からなり、534残基の成熟タンパク質と38残基のリーダーペプチドを含む。リーダーのC末端側に存在する19残基の疎水性アミノ酸は、既知のシグナルペプチドと性状が類似しており、シグナルペプチドとしての役割も担う可能性がある。スペクトル解析により、二価銅イオンがCys、MetおよびHis残基に結合し得ることが示された。ビリルビンオキシダーゼ遺伝子配列は、5つのイントロンにより6つのエクソンに分割される。すべてのイントロン境界はGTおよびAGの二本鎖ヌクレオチドで標識される。プライマー伸長法により4つの転写開始点が同定され、主要な転写開始点はATG開始コドンの上流93塩基に位置していた。

性質

ビリルビンオキシダーゼの等電点は約4.1である。本酵素のミカエリス定数は菌株によりわずかに異なる。一般に、ビリルビンオキシダーゼは37℃およびpH 5.0～9.7の範囲で安定であり、5℃かつpH 9.2～9.7で最も安定である。最適反応温度は約40℃、最適反応pHは約8であり、酸性域では溶解しにくい。報告されている分子量は52 kDaおよび68 kDaであり、この差は天然ビリルビンオキシダーゼに存在するオリゴ糖鎖に起因する可能性がある。Penicillium janthinellumにおけるビリルビンオキシダーゼの分子量は2000 kDaであり、これは金属イオンが酵素タンパク質を架橋しているためである。アスコルビン酸およびシアン化カリウムを用いて二価銅イオンを除去すると、ビリルビンオキシダーゼは活性を失う。アポ型ビリルビンオキシダーゼは、コバルト、カドミウムおよび鉄イオンをそれぞれ添加することで、程度の差はあるものの活性を回復する。これは、ビリルビンオキシダーゼの触媒能が金属イオンと密接に関連することを示唆する。水銀イオンは酵素活性の増加を顕著に促進し得るが、これは水銀イオンと基質が結合して、酵素触媒により適した中間体を形成するためである。シアン化カリウム、アジ化ナトリウムおよびチオ尿素は反応を阻害する。ビリルビンオキシダーゼはテトラピロール含有化合物に特異的に反応し、さらに一部のラッカーゼ基質も酸化し得る。

触媒機構

ビリルビンオキシダーゼは銅含有ポリフェノールオキシダーゼであり、3種類の銅イオンを含む。タイプI銅イオンは、基質から他の銅部位への電子移動を媒介する。酸素分子は、タイプII銅イオン1個およびタイプIII銅イオン2個からなる三核中心に結合し、2分子の水へと還元される。したがって、その触媒過程は分子状酸素を電子受容体として利用する酸化反応である。電子吸収スペクトロスコピーおよび薄層クロマトグラフィーにより検出された特異反応は、ビリルビン + 1/2 O₂ → ビリベルジン + H₂O である。この過程では、ビリルビンオキシダーゼがビリルビンを触媒してビリベルジンを生成し、さらにビリベルジンが酸化されて無色の物質を形成する。研究により、ビリルビンオキシダーゼの触媒機構は、タンパク質に結合した銅イオンに対する二次反応であることが示されている。ドナー構造はCuSS*N2（S＝Cys、S*＝Met、N＝His）型であり、セルロプラスミンファミリーと同一である。黄疸血に対するビリルビンオキシダーゼ反応において、血中ビリルビン濃度をHPLCで測定したところ、ビリルビンオキシダーゼは抱合型ビリルビンを酸化するだけでなく、非抱合型ビリルビンも酸化し得ることが確認された。塩化ナトリウム等の試薬の存在下では、ビリルビンオキシダーゼは抱合型ビリルビンを選択的に酸化し得る。

臨床応用

多様な肝疾患によりビリルビン代謝障害が生じ得る。ビリルビンの増加は黄疸の発現につながる。したがって、ビリルビン測定は肝機能の重要な指標である。ビリルビンオキシダーゼはビリルビンを触媒してビリベルジンを生成する。440 nmおよび450 nmにおける吸光度変化を測定することで、血清中ビリルビン含量を定量する。したがって、ビリルビンオキシダーゼは黄疸疾患の臨床診断に使用でき、新生児黄疸および高ビリルビン血症の治療への応用が期待される。