アルコールオキシダーゼ

アルコールオキシダーゼ（AOX、EC 1.1.3.13）はフラビン酵素であり、アルコールを対応するカルボニル化合物へ酸化すると同時に過酸化水素を放出する反応を触媒する酸化還元酵素である。本酵素の系統名は alcohol:oxygen oxidoreductase である。一般に用いられる別名として、エタノールオキシダーゼ、メタノールオキシダーゼがある。基質特異性に基づき、アルコールオキシダーゼは概ね4群、すなわち短鎖アルコールオキシダーゼ（SCAO）、長鎖アルコールオキシダーゼ（LCAO）、芳香族アルコールオキシダーゼ（AAO）、二級アルコールオキシダーゼ（SAO）に大別される。アルコールオキシダーゼは主として細菌、酵母、真菌、植物、昆虫および軟体動物に由来する。SCAOおよびLCAOは主に細胞内酵素である一方、AAOおよびSAOは多くが培地中へ分泌される。

分類

AOXは、アルコールを対応するアルデヒドまたはケトンへ変換する触媒反応にフラビン系補因子を必要とする。AOXに含まれるFADは酵素の酸化還元中心と密接に関連し、アルコール基質から分子状酸素へのヒドリドイオン移動に関与することでH₂O₂を生成する。AOX活性は当初、Polystictus versicolorで報告され、その後、研究者らは当該担子菌から、メタノールおよびその他の低級アルコールを対応するアルデヒドとH₂O₂へ酸化する酵素を単離した。彼らはこの酵素を「アルコールオキシダーゼ」と命名し、結晶状態まで精製し、さらにFADが本酵素の補欠分子族であることを見出した。基質特異性に基づき、アルコールオキシダーゼは概ね4群、すなわち短鎖アルコールオキシダーゼ（SCAO）、長鎖アルコールオキシダーゼ（LCAO）、芳香族アルコールオキシダーゼ（AAO）および二級アルコールオキシダーゼ（SAO）に大別される。

構造

グルコース‐メタノール‐コリン（GMC）酸化還元酵素スーパーファミリーの他のメンバーと同様に、Pichia pastorisのAOX1は、FAD結合ドメイン（残基1–155、192–306、および568–663）および基質結合ドメイン（残基156–191および307–567）という2つの特徴的ドメインを有する。最も保存性が高い領域はFAD結合ドメインであり、一次配列全体に分散した4つの配列断片から構成され、P. pastoris AOX1では、特徴的なFADヌクレオチド結合部位配列GXGXXGおよびGGGSSGを含む。

図1．P. pastoris AOX1サブユニット1分子の構造。（Koch C. 2016）

AOX1の成熟した活性型は、同一の8つのサブユニットからなるオリゴマーであり、各サブユニットは補欠分子族として非共有結合性に結合したフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）分子を1分子ずつ有する。P. pastoris AOX1の結晶は、約121.8 Å × 133.8 Å × 134.5 Åのサイズを有するホモ八量体である。この八量体は二量体の四量体として見えるが、互いに向かい合わせに配置された2つの四量体として記述することもできる。2つの四量体は基質結合ドメインを介してのみ相互作用し、FAD結合ドメインはオリゴマーの外表面を占める。四量体内では、各モノマーが隣接する2つのサブユニットそれぞれと20本の水素結合および8つの塩橋を形成し、ペア相互作用における接触表面積の7%（1985 Ų）を占有する。これに対し、四量体間の各二量体は、より広範なサブユニット間接触（40本の水素結合）により安定化され、接触表面積の10%（2700 Ų）が埋没する。八量体形成時には、各モノマーが隣接サブユニットと約115本の水素結合および16の塩橋を形成し、自身の接触表面積の約29%（8300 Ų）が埋没することから、八量体の強固さが示唆される。AOX1のオリゴマー状態の形成は主として、モノマー間に多数の相互作用を挿入すること（残基326–351、486–548、247–251、638–663）により促進される。挿入の1つは基質結合ドメイン（367–386）に位置するが、ヘリックス‐ループ‐ヘリックスモチーフを形成し、他のモノマーから離れた位置にあるためサブユニット間相互作用には関与しない。一方、残る2つの挿入（326–351、486–548）は、AOX1八量体の四量体および二量体サブアセンブリーの形成に関与する。これらの長さと内在的な構造可塑性に加え、各個体の対面配置が相まって、各挿入が2つのサブアセンブリーの安定化に同時に寄与する広範な相互作用ネットワークの形成を可能にする。これに対し、離れた位置にある短いループ延長（残基247–251）およびFAD結合ドメインのC末端延長は、四量体形成に関与する隣接2モノマー間の相互作用を介してのみ四量体形成に寄与する。

図2．P. pastoris AOX1の四次構造。（Koch C. 2016）

触媒機構

AOX1の結晶構造解析により、活性部位が溶媒からアクセス不能であることが示された。AOX1の触媒中心は溶媒非アクセス性であるにもかかわらず、全ての活性部位において水分子に対応する電子密度ピークが観察される。この水分子は約135 ųの体積を有する小さな空洞を占有し、Asn616およびHis567の側鎖、ならびにイソアロキサジン環のN5原子と水素結合している。さらなる研究により、Phe98およびMet100の側鎖が、基質の活性部位への進入を可能にする構造要素である可能性が示された。AOX1の8つのサブユニットの触媒中心はそれぞれ、非共有結合性に結合したFAD分子を含む。

図3．AOX1の活性部位。（Koch C. 2016）

メチロトロフ酵母は、天然に存在するリビチルFAD部分を修飾アラビチルFAD（a-FAD）へ自動的に変換することにより、アルコールオキシダーゼ活性を精緻に調節する制御機構を進化させてきた。a-FADはV_maxをわずかに低下させ、基質メタノールに対する酵素のK_m値を有意に低下させる。これは低メタノール濃度条件での培養において生理学的意義を有する。AOXが触媒する多段階反応は結合補因子の酸化還元電位に直接依存するため、FADの酸化還元電位の上昇は酵素全体の変換に寄与する。AOXのFADにおける原子C2’のキラル配置の変化は、修飾a-FADのアリルC2’ OH基とイソアロキサジン環系のN1原子との間に新たな分子内水素結合を形成し、これがFAD補因子の酸化還元電位を調節している可能性が高い。触媒酸化反応は、触媒塩基による基質ヒドロキシルプロトンの引き抜きにより開始し、基質α炭素からのヒドリド移動に先立ってアルコキシド種を形成する。他のアルコールオキシダーゼ（AAO、GO、CDH、P2O、PNO）では、His/His、His/AsnまたはHis/Proペアにおける保存性の高いHisが触媒塩基と考えられており、触媒反応中に部分正電荷を帯びるとされる。AOX1ではHis567がアルコールを活性化する触媒塩基として同定された。AOX1が触媒する段階的反応では、酵素が分子間相互作用によりアルコキシドの負電荷を安定化する必要があり、これは保存性の高い2つの極性残基であるHis567およびAsn616により形成され得る。この残基はアルコキシド部位から離れた水素結合位置に存在する。ヒドリドイオンの移動はイソアロキサジン環のN5位を介して行われるため、N5原子に隣接する極性基は遷移状態を安定化し得る。AOX1においてOH基が配置される残基はPhe98である。

図4．修飾a-FAD。（Koch C. 2016）

参考文献