アルコールオキシダーゼ

アルコールオキシダーゼ (AOX, EC 1.1.3.13) はフラボ酵素であり、アルコールを対応するカルボニル化合物に酸化し、同時に過酸化水素を放出する酸化還元酵素です。この酵素の系統名はアルコール:酸素酸化還元酵素です。一般的に使用される他の名前にはエタノールオキシダーゼ、メタノールオキシダーゼが含まれます。基質特異性に応じて、アルコールオキシダーゼは大きく4つの異なるグループに分けられます。すなわち、短鎖アルコールオキシダーゼ (SCAO)、長鎖アルコールオキシダーゼ (LCAO)、芳香族アルコールオキシダーゼ (AAO)、および二次アルコールオキシダーゼ (SAO) です。アルコールオキシダーゼは主に細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、軟体動物から得られます。SCAO と LCAO は主に細胞内に存在し、AAO と SAO は主に培地に分泌されます。

分類

AOX は、アルコールを対応するアルデヒドまたはケトンに変換するためにフラビンベースの補因子を必要とします。AOX の FAD は酵素のレドックス中心に密接に関連しており、アルコール基質から分子酸素への水素イオンの移動に関与し、H₂O₂ を生成します。AOX の活性は最初に Polystictus versicolor で報告され、その後、研究者たちはメタノールや他の低級アルコールを対応するアルデヒドと H₂O₂ に酸化する酵素をバシジオマイセテから単離しました。彼らはこの酵素を「アルコールオキシダーゼ」と名付け、結晶状態に精製し、FAD が酵素の補因子であることを発見しました。基質特異性に応じて、アルコールオキシダーゼは大きく4つの異なるグループに分けられます。すなわち、短鎖アルコールオキシダーゼ (SCAO)、長鎖アルコールオキシダーゼ (LCAO)、芳香族アルコールオキシダーゼ (AAO)、および二次アルコールオキシダーゼ (SAO) です。

構造

グルコース-メタノール-コリン (GMC) 酸化還元酵素スーパーファミリーの他のメンバーと同様に、Pichia pastoris AOX1 には、FAD 結合ドメイン (残基 1-155, 192-306, および 568-663) と基質結合ドメイン (残基 156-191 および 307-567) の2つの特徴的なドメインが含まれています。最も保存された領域は FAD 結合ドメインであり、主鎖配列全体に分布する4つの配列断片を含み、P. pastoris AOX1 では特徴的な FAD ヌクレオチド結合部位の配列 GXGXXG および GGGSSG が見られます。

図 1. 一つの P. pastoris AOX1 サブユニットの構造。 (Koch C. 2016)

成熟した活性型の AOX1 は、8つの同一のサブユニットからなるオリゴマーであり、それぞれが補因子として非共有結合で結合したフラビンアデニンジヌクレオチド (FAD) 分子を持っています。P. pastoris AOX1 結晶は、約 121.8 Å x 133.8 Å x 134.5 Å のサイズを持つホモオクタマーです。このオクタマーは、二量体のテトラマーであるように見えますが、対面に配置された2つのテトラマーとしても説明できます。2つのテトラマーは基質結合ドメインを介してのみ相互作用し、FAD 結合ドメインはオリゴマーの外側表面を占めています。テトラマーでは、各モノマーが隣接する2つのサブユニットと20の水素結合と8の塩橋を形成し、ペア相互作用における接触表面積の7% (1985 Ų) を占めます。対照的に、各インターテトラマーダイマーは、より広いサブユニット間の接触 (40の水素結合) によって安定化され、接触表面積の10% (2700 Ų) を埋めます。オクタマーが形成されると、各モノマーは隣接するサブユニットと約115の水素結合と16の塩橋を形成し、接触表面積の約29% (8300 Ų) を埋めます。これはオクタマーの強度を示しています。AOX1 のオリゴマー状態の形成は、モノマー間の多数の相互作用の挿入によって主に促進されます (残基 326-351, 486-548, 247-251, 638-663)。1つの挿入は基質結合ドメイン (367-386) に位置しており、他のモノマーから離れた位置にあるヘリックス-ループ-ヘリックスモチーフが形成され、したがってサブユニット間の相互作用には参加しません。残りの2つの挿入 (326-351, 486-548) は、AOX1 オクタマーのテトラマーおよびダイマーサブアセンブリの形成に関与しています。これらの長さと固有の構造的可塑性は、個々の対面配置と組み合わさって、各プラグインが2つのサブアセンブリの安定化に同時に参加する広範な相互作用ネットワークの形成を促進します。対照的に、遠くの短いループの延長 (残基 247-251) と FAD 結合ドメインの C末端の延長は、テトラマーの形成にのみ参加し、テトラマーの形成に関与する2つの隣接モノマーの相互作用によってテトラマーを形成します。

図 2. P. pastoris AOX1 の四次構造。 (Koch C. 2016)

触媒メカニズム

AOX1 の結晶構造の分析により、活性部位が溶媒にアクセスできないことが示されました。AOX1 の触媒中心は溶媒にアクセスできないものの、すべての活性部位で水分子に対応する電子密度ピークが観察されます。水分子は約 135 ų の体積を持つ小さな空洞を占め、Asn616、His567、およびイソアロキサジン環の N5 原子の側鎖と水素結合しています。さらなる研究により、Phe98 および Met100 の側鎖が基質が活性部位に入ることを可能にする構造要素である可能性があることがわかりました。AOX1 の8つのサブユニットの触媒中心には、それぞれ非共有結合で結合した FAD 分子が含まれています。

図 3. AOX1 の活性部位。 (Koch C. 2016)

メチロトロフィック酵母は、自然に存在するリビチル FAD 部分を修飾されたアラビチル FAD (a-FAD) に自動的に変換することによって、アルコールオキシダーゼの活性を微調整する調節メカニズムを進化させました。a-FAD は V_max をわずかに低下させ、基質メタノールに対する酵素の K_m 値を大幅に低下させます。これは低メタノール濃度の培養において生理的に関連しています。AOX が触媒する多段階反応は、結合した補因子のレドックス電位に直接依存しているため、FAD のレドックス電位の増加は酵素の全体的な変換に寄与します。AOX の FAD における原子 C2' のキラル構成の変化は、修飾された a-FAD アリール C2' OH グループとイソアロキサジン環系の N1 原子との間に新しい分子内水素結合を形成し、最も可能性が高いのは FAD 補因子のレドックス電位を調整します。触媒酸化反応は、基質の水酸基プロトンを触媒塩基によって除去し、基質のα-炭素から水素移動が行われる前にアルコキシド種を形成することから始まります。他のアルコールオキシダーゼ (AAO, GO, CDH, P2O, PNO) では、His/His、His/Asn または His/Pro ペアの保存された His が触媒塩基と見なされ、したがって触媒中に部分的な正電荷を持ちます。AOX1 の His567 はアルコールを活性化する触媒塩基として特定されました。AOX1 によって触媒される段階的反応は、アルコキシドの負電荷を分子間相互作用によって安定化するために酵素が必要であり、これは保存された2つの極性残基、His567 と Asn 616 によって形成される可能性があります。この残基はアルコキシド部位から遠く離れた水素結合に位置しています。水素イオンの移動はイソアロキサジン環の N5 位を介して行われるため、N5 原子に隣接する極性基は遷移状態を安定化できます。AOX1 では、OH グループが配置されている残基は Phe98 です。

図 4. 修飾された a-FAD。 (Koch C. 2016)

参考文献