アッセイ選定前にスクリーニング質問を定義する

最も重要なアッセイ上の意思決定要因は機器ではない。スクリーニングの目的である。広範なディスカバリー・スクリーニングでは、迅速性と粗酵素調製物に対する許容性が求められる場合がある。合成ルートの実現可能性評価スクリーニングでは、生成物同一性の確認および立体化学の確認が必要となる場合がある。プロセス最適化スクリーニングでは、定量的な転化率、初速度、マスバランス、ならびに不純物の追跡管理が必要となる場合がある。アッセイの目的が明確に定義されていない場合、スクリーニングは見栄えのする数値を示しても、ルート選定の意思決定を裏付けない結果となり得る。

バイオ触媒スクリーニングにおいては、アッセイが真の酵素的変換を、基質の不安定性、バックグラウンドの化学反応、シグナル干渉、生成物形成を伴わない補酵素サイクリング、ならびにライセート、細胞、共溶媒または製剤に起因するマトリックス効果から明確に識別できることが求められる。さらに、標的分子の特性も重要である。発色性モデル基質は酵素ファミリーのプロファイリングには有用である一方、医薬品中間体、天然物アナログ、高分子基質、脂質基質、または難溶性の合成化合物に対する活性を予測できない場合がある。

適切な活性アッセイ法の選定

すべてのバイオ触媒スクリーニングに対して万能な単一のアッセイ法は存在しない。比色法および蛍光法は迅速で高感度かつマイクロプレート適合性に優れる一方、しばしば間接測定となる。クロマトグラフィー法はより時間を要するが、目的生成物および副生成物の確認が可能である。LC-MSおよびGC-MSは同定ならびに微量レベルの検出に有用であるが、イオン抑制や誘導体化に起因するアーチファクトを適切に管理するため、慎重なキャリブレーションと管理が求められる。カップリングアッセイは不可視の反応を測定可能にできるが、カップリング酵素が潜在的な律速要因とならないよう留意する必要がある。

手法の選定にあたっては、基質構造、生成物の検出可能性、想定される反応速度、サンプルマトリクス、補因子の化学特性、スループット、データポイント当たりのコスト、ならびに立体化学の評価要否を考慮すべきである。初期スクリーニングでは、二段階アプローチが最も堅牢である場合が多い。すなわち、高スループットなリードアウトで候補を同定し、その後、選抜したヒットについて直接的な生成物アッセイにより確認する。

マイクロプレートスクリーニング設計

マイクロプレートアッセイは、多数の酵素、変異体、発現条件、または反応パラメータをスクリーニングする上で有用である。試薬消費量を低減し、プレート間での統計学的比較を可能にする。一方で、マイクロプレートデータは、蒸発、エッジ効果、光路長、混合不良、沈殿、気泡、酸素移動、蛍光干渉、およびタイミング差の影響を受けやすい。したがって、プレートリーダーがクリーンなシグナルを示すという理由だけで信頼性を前提とするのではなく、当該反応に対してマイクロプレートアッセイをバリデーションすべきである。

優れたマイクロプレートスクリーニングでは、プレートレイアウト、リプリケート設計、陽性対照、陰性対照、反応開始方法、クエンチ方法、インキュベーション時間、温度、シェーキング条件、測定間隔、および受入基準を明確に規定する。速度論的アッセイでは、測定値は初速度領域に維持されるべきである。エンドポイントアッセイでは、シグナルを飽和させることなく、活性候補と不活性候補を識別可能な範囲に反応変換率を維持すべきである。粗溶解液または全細胞スクリーニングでは、タンパク質含量、細胞密度、バックグラウンド活性、およびマトリックスの呈色の影響を正規化または管理する必要がある。

一次スクリーニング後の確認的製品分析

一次スクリーニングは、候補を迅速に抽出することを目的として設計される。確認分析は、誤った意思決定（偽陽性・偽陰性）からプロジェクトを保護することを目的として設計される。確認法は、可能な限り実基質および実生成物を直接測定できる方法とすべきである。これは、酸化還元酵素においては生産的な生成物形成を伴わずにNAD(P)Hの変動が生じ得る点、トランスアミナーゼにおいてはドナーおよび共生成物の平衡により間接アッセイが誤認を招き得る点、加水分解酵素においては発色性モデル基質が標的エステル、アミド、脂質、またはポリマーに対する活性を予測できない場合がある点から、特に重要である。

確認試験には、通常、経時変化（タイムコース）、検量線またはレスポンスファクター、基質回収率、生成物同一性の根拠、および副生成物の評価を含めるべきである。標的反応が立体選択的である場合、ヒットを次段階へ進める前にキラル分析を実施すべきである。アッセイがカップリング（連結）測定系を用いる場合、直接分析により、カップリング酵素、補因子、ドナー、または指示薬（インジケーター）化学が結果に影響を及ぼしたか否かを検証すべきである。

管理、校正、および分析法バリデーション

バイオ触媒スクリーニングにおいて、対照（コントロール）は任意ではありません。対照は、得られたシグナルが何を意味するのかを規定します。少なくとも、多くのスクリーニングでは、酵素無添加対照、基質無添加対照、陽性対照、マトリクスブランク、および試薬ブランクが必要です。化学反応系に応じて、熱失活酵素対照、補因子無添加対照、再生系無添加対照、基質安定性対照、ならびに生成物安定性対照も要求される場合があります。対照は、予備的な方法設定の段階に限らず、スクリーニングと同一条件下で実施すべきです。

キャリブレーションは、報告される結果（アウトプット）を適切に反映している必要がある。画面表示が活性単位である場合、アッセイでは基質、生成物、反応時間、温度、pH、酵素量、および直線範囲を定義しなければならない。画面表示が変換率である場合、生成物および基質の応答係数を把握していること、または慎重に推定していることが求められる。画面表示が蛍光または吸光度によりヒットを順位付けする場合、標準品およびマトリクス適合コントロールにより、選抜に用いる範囲においてシグナルが直線性を維持していることを示さなければならない。

バイオ触媒スクリーニングにおける偽陽性および偽陰性

偽陽性はフォローアップに要するリソースを浪費し、ルート開発を誤った方向へ導きかねません。偽陰性も同様に深刻であり、有用な酵素を過度に早期の段階で除外してしまいます。いずれも、スクリーニングアッセイをモデル系から実基質へ移管する際に再バリデーションを実施しない場合に頻発します。

偽陽性は、着色または蛍光性化合物、自発的な基質加水分解、共役していない補因子消費、粗溶解液中の内因性活性、基質ストック中の生成物様不純物、またはカップリングアッセイ由来のアーティファクトに起因することが多い。偽陰性は、基質溶解性不良、補因子の欠落、pH設定不適切、生成物阻害、発現量低下、酵素不安定性、共溶媒の不適合、またはアッセイシグナルのクエンチングに起因することが多い。目的は初回スクリーニングであらゆる潜在的アーティファクトをすべて排除することではなく、ルート選定の意思決定を行う前にそれらを検知できるワークフローを設計することである。

データ解釈およびヒットのトリアージ

スクリーニングデータは、段階（ティア）に分けて解釈すべきである。第1ティアでは、シグナルがバックグラウンドを上回っており、かつ再現性があるかを確認する。第2ティアでは、そのシグナルが目的とする製品に対応しているかを確認する。第3ティアでは、当該ヒットが、想定するプロジェクトに必要な選択性、活性、安定性および適合性を備えているかを評価する。この段階的アプローチにより、初期スクリーニングの過負荷を回避しつつ、不適切な意思決定からプロジェクトを保護できる。

ヒットのトリアージでは、対照に対する活性、生成物同一性、選択性、基質負荷、酵素負荷、反応時間、補因子またはドナーの要求量、pH安定性、溶解性、ならびに副生成物を考慮すべきである。優れた立体選択性と良好なマスバランスを示す中程度の活性ヒットは、生成物同一性が不明な高シグナルのヒットよりも価値が高い場合がある。同様に、所望の選択性を有し、かつ酵素工学（酵素改変）を支援し得るのであれば、弱いヒットであっても開発候補として前進させる価値がある。

バイオ触媒スクリーニングにおける酵素活性アッセイに関する依頼事項

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関連するCreative Enzymesのリソース

これらのリソースは、活性アッセイ開発を、酵素スクリーニング、合成ルートの実現可能性評価、トラブルシューティング、および下流工程の最適化と結び付けます。

バイオ触媒スクリーニングにおける酵素活性アッセイに関するFAQ

• Q：比色法または蛍光アッセイは、HPLCによる確認試験の代替となり得ますか？

  A：迅速な一次スクリーニングには有用ですが、ルート選定の意思決定には通常、目的生成物の生成確認、選択性、および副生成物の直接的な確認が必要です。光学アッセイは、クロマトグラフィーによるフォローアップと組み合わせることで、特に有用性が高まります。

• Q：なぜ、NADHまたはNADPHの吸光度は、酸化還元酵素のスクリーニングにおいて、ときに誤解を招くことがあるのですか？

  A：意図した基質の生産的な変換を伴わずに、補因子の消費または生成が生じる場合がある。アンカップリング反応（uncoupled turnover）、バックグラウンド酸化、基質の吸光、または補因子再生系の化学反応により、シグナルが変動し得る。

• Q：新規スクリーニングアッセイにおいて最も重要なコントロールは何ですか？

  A：無酵素対照、陽性対照酵素、マトリックスブランク、無基質対照、標準曲線、および直交法による生成物確認が、しばしば最も重要な出発点となります。追加の対照は化学的特性に依存します。

• Q：スクリーニングでは、初期反応速度を測定すべきか、それともエンドポイントでの転換率を評価すべきか。

  A：初速度は、アッセイが線形範囲にある場合に酵素活性を比較するうえで有用である。エンドポイントでの転換率は、合成ルートの実現可能性評価に有用である。多くのプロジェクトでは両者の併用が有益であり、初期スクリーニングは速度（レート）で実施し、ヒットの確認は経時的な転換率（タイムコース）で行う。

• スクリーニングアッセイを設計するために必要な情報は何ですか。

  A：標的反応、基質および生成物の構造、酵素ファミリー、アッセイの目的、入手可能な標準品、補因子、サンプルマトリクス、想定スループット、ならびに現行の分析上の制約が、最も有用な出発点となります。