TdT

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TdT（EC 2.7.7.31、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）は、DNAポリメラーゼのPol Xファミリーに属する。TdTは哺乳類で最初に同定されたDNAポリメラーゼであり、1960年に子牛胸腺抽出物から精製された。本酵素の受容名はDNAヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼである。一般に用いられる別名として、terminal addition enzyme、terminal deoxynucleotidyltransferase、terminal deoxyribonucleotidyltransferase、terminal transferaseがある。TdTは核酸基質として一本鎖DNAのみを使用し、鋳型非依存的にヌクレオチドを取り込むことでDNA合成を完了する。V(D)J組換えの際、TdTは一本鎖DNAに核酸をランダムに付加する。遺伝物質の精緻なランダム化を通じて、TdTは脊椎動物免疫系の進化および適応において重要な役割を担う。TdTのランダムなヌクレオチド取り込み能は、多様な免疫グロブリンおよびT細胞抗原受容体の産生に寄与し、抗原受容体の多様性を増大させる。

構造

TdTの構造は、XファミリーDNAポリメラーゼに共通する特徴と類似しており、C末端にPolβ様ドメインを有し、thumb、fingers、palm、および8 kDaドメインから構成される。TdTには、酵素と鋳型鎖との相互作用を阻害する「投げ縄（lariat）様」ループも存在する。さらに、index fingerドメインとも呼ばれる8 kDaドメインはthumbドメインと接触して空洞を形成し、dNTPが酵素の活性部位へ拡散到達できるようにする。この特徴により、TdTの一般的形態はリング状構造として定義され、プライマーはpalmドメイン上の空洞軸に対して垂直に配置される。Polβ様ドメインに加えて、TdTのN末端には核局在化シグナル（NLS）モチーフおよび乳がん感受性タンパク質BRCA1のC末端（BRCT）ドメインが含まれる。BRCTドメインは、DNA損傷後のDNA修復経路および細胞周期チェックポイント制御において、タンパク質／タンパク質ならびにタンパク質／DNA相互作用を媒介する。TdTのBRCTドメインは、V(D)J組換えおよび二本鎖切断修復の際に遊離DNA末端を認識して結合するタンパク質ヘテロ二量体であるKu70/86と相互作用する。

図1. XファミリーDNAポリメラーゼのドメイン構成。（Fowler J.D. 2006）

図2. Polβ様ドメインの構造。（Fowler J.D. 2006）

触媒機構

XファミリーDNAポリメラーゼの顕著な特徴として、触媒部位が高度に保存されている点が挙げられ、厳密に保存された3つのアスパラギン酸残基が、二金属イオン機構に関与する2つの必須金属イオンを配位する。金属Aは末端ヌクレオチドの3'OHを活性化し、αリン酸への求核攻撃を可能にする。一方、金属Bはヌクレオシド三リン酸とともに進入し、脱離基（PPi）を安定化する。TdTでは、Mn⁺⁺、Co⁺⁺、Zn⁺⁺などの遷移金属イオンを含む二価金属イオンの配位幾何が、完全な触媒部位において原子レベルで検討されており、これらの金属イオンはMg⁺⁺よりもヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性が高い。新たに伸長したプライマー鎖を次の付加のために触媒部位へ転座させるには、金属Aが離脱し、Na⁺に置換される必要がある。

図3. DNAシナプシスに結合したTdTの機構。（Loc’h J. 2018）

TdTは、少なくとも3ヌクレオチド長の一本鎖DNAプライマーに対し、鋳型非依存的にランダムなデオキシリボヌクレオチド（dNTP）を付加できる。in vitro試験では、TdTは4種類の天然dNTPを利用可能であることが示されているが、dATPおよびdTTPと比較してdCTPおよびdGTPを優先的に取り込む。さらに、TdTのヌクレオチド結合部位は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオシド三リン酸（dNTPおよびrNTP）を収容できる。

応用

TdTは抗がん標的として利用可能である。臨床的エビデンスから、TdT活性および発現レベルの変化が、がんの発症、進行、ならびに化学療法応答において重要な役割を果たすことが示唆されている。B細胞性およびT細胞性急性リンパ性白血病（ALL）ならびに急性骨髄性白血病（AML）ではTdT発現が亢進しており、TdT活性が高いことは予後不良と関連する。研究により、TdT陽性患者はTdT陰性の白血病患者と比較して寛解率が約2分の1に低下することが示されている。これらの知見は、これらの白血病に対する化学療法薬として作用するTdT選択的阻害剤の研究開発を促進している。

TdTは生化学的ツールとしても利用できる。TdTは多様なヌクレオチドアナログを利用可能であり、ヌクレオチドの多数の修飾に対して高い許容性を示すため、二本鎖DNAの切断部位をin vivoおよびin vitroで標識するための効率的手法を提供する。TUNT（TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling）はTdTに基づく技術であり、DNA切断部位における一本鎖DNAの3'末端にビオチン化dUMPを効率的に取り込ませる。結合したビオチンdUMPは蛍光標識により検出可能であり、DNA切断の数および位置を直接定量できる。本技術は、真核細胞におけるアポトーシスおよびプログラム細胞壊死の検出に一般的に用いられる。さらにTdTは、生体触媒として合成オリゴヌクレオチドの3’末端を放射性ヌクレオチドまたは蛍光プローブで標識する用途にも使用できる。これらの標識プライマーは相補鎖にアニーリングさせることで、核酸代謝に関与する酵素活性を検出するための放射性基質として利用できる。

参考文献

1. Fowler, J.D., Suo, Z. Biochemical, structural, and physiological characterization of terminal deoxynucleotidyl transferase. Chem. Rev, 2006, 106:2092−2110.
2. Loc’h, J., Delarue, M. Terminal deoxynucleotidyltransferase: the story of an untemplated DNA polymerase capable of DNA bridging and templated synthesis across strands. Curr Opin Struct Biol, 2018, 53:22-31.
3. Motea, E.A., Berdis, A.J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: the story of a misguided DNA polymerase. Biochim Biophys Acta, 2010, 1804(5): 1151–1166.