TdT

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TdT (EC 2.7.7.31, ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ)は、ポリ XファミリーのDNA ポリメラーゼに属します。TdTは、哺乳類で最初に同定されたDNAポリメラーゼであり、1960年に子牛の胸腺抽出物から精製されました。この酵素の受け入れられた名称は DNAヌクレオチジルエクストランスフェラーゼです。一般的に使用される他の名称には、ターミナル追加酵素、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼが含まれます。TdTは、単鎖DNAのみを核酸基質として使用し、テンプレートに依存しない方法でヌクレオチドを取り込んでDNA合成を完了します。V(D)J再編成時に、TdTは単鎖DNAにランダムに核酸を追加します。遺伝物質の微妙なランダム化を通じて、TdTは脊椎動物の免疫系の進化と適応に重要な役割を果たします。TdTがランダムにヌクレオチドを取り込む能力は、異なる免疫グロブリンおよびT細胞抗原受容体の生成に寄与し、抗原受容体の多様性を高めます。

構造

TdTの構造は、すべてのXファミリーDNAポリメラーゼと似ており、C末端にPolβ様ドメインがあり、サム、フィンガー、パーム、8 kDaドメインを含んでいます。TdTには、酵素とテンプレート鎖との相互作用を防ぐ「ラリアット様」ループもあります。さらに、8kDaドメイン（インデックスフィンガードメインとも呼ばれる）は、サムドメインと接触して、dNTPが酵素の活性部位に拡散できる空洞を形成します。この特徴により、TdTの一般的な形状は、プライマーがパームドメインの空洞の軸に対して垂直なリング構造として定義されます。Polβ様ドメインに加えて、TdTのN末端には核局在シグナル（NLS）モチーフと乳がん感受性タンパク質BRAC1 C末端 (BRCT)が含まれています。BRCTドメインは、DNA損傷後のDNA修復経路および細胞周期チェックポイント調節において、タンパク質/タンパク質およびタンパク質/DNA相互作用を媒介します。TdTのBRCTドメインは、V(D)J再編成および二本鎖切断修復中に自由DNA末端を認識し結合するタンパク質ヘテロダイマーであるKu70/86と相互作用します。

図 1. XファミリーDNAポリメラーゼのドメイン構成. (Fowler J.D. 2006)

図 2. Polβ様ドメインの構造. (Fowler J.D. 2006)

触媒メカニズム

XファミリーDNAポリメラーゼの顕著な特徴は、触媒部位が非常に保存されており、3つの厳密に保存されたアスパラギン酸が、2つの必須金属イオンを調整して二金属イオンメカニズムに参加していることです。金属Aは、最後のヌクレオチドの3'OHを活性化し、αリン酸の攻撃を可能にし、金属Bはヌクレオシド三リン酸とともに安定した離脱基（PPi）に入ります。TdTでは、Mn⁺⁺、Co⁺⁺ およびZn⁺⁺などの遷移金属イオンを含む二価金属イオンの配位幾何学が、完全な触媒部位の間に原子詳細に研究されており、ヌクレオチジルトランスフェラーゼに対するその活性はMg⁺⁺よりも効率的です。新たに延長されたプライマーストランドを新しい追加のために触媒部位に移動させるためには、金属Aが退出し、Na⁺に置き換えられなければなりません。

図 3. DNAシナプシスに結合したTdTのメカニズム. (Loc’h J. 2018)

TdTは、少なくとも3ヌクレオチドの長さのssDNAプライマーに対して、テンプレートに依存しない方法でランダムなデオキシリボヌクレオチド（dNTP）を追加できます。in vitro実験では、TdTが4つの天然dNTPを使用できることが示されていますが、TdTはdATPおよびdTTPと比較してdCTPおよびdGTPを優先的に取り込みます。さらに、TdTのヌクレオチド結合部位は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオシド三リン酸（dNTPおよびrNTP）を収容できます。

応用

TdTは、抗癌ターゲットとして使用できます。臨床的証拠は、TdTの活性と発現レベルの変化が癌の発生、進行、および化学療法反応に重要な役割を果たすことを示唆しています。B細胞およびT細胞急性リンパ芽球性白血病（ALL）および急性骨髄性白血病（AML）では、TdTの発現が上昇し、高レベルのTdT活性は予後不良と関連しています。研究により、TdT陽性患者はTdT陰性白血病患者と比較して寛解率が2倍低下することが示されています。これらの発見は、これらの白血病の形態に対する化学療法剤として作用するTdTの選択的阻害剤の研究を促進しました。

TdTは、生化学的ツールとしても使用できます。TdTはさまざまなヌクレオチドアナログを利用でき、TdTはヌクレアーゼの多くの修飾に耐性があり、in vivo およびin vitro での二本鎖DNAの切断をラベリングする効率的な方法を提供します。TUNT（TdT媒介dUTP-ビオチンニックエンドラベリング）は、TdTベースの技術であり、DNA切断部位で単鎖DNAの3'末端にビオチン化されたdUMPを効率的に取り込みます。結合したビオチンdUMPは蛍光ラベリングによって検出でき、DNA切断の数と位置を直接定量化できます。この技術は、真核細胞におけるアポトーシスおよびプログラム細胞壊死を検出するために一般的に使用されます。TdTはまた、合成オリゴヌクレオチドの3'末端に放射性ヌクレオチドまたは蛍光プローブをラベル付けするための生物触媒として使用できます。これらのラベル付きプライマーは相補鎖にアニーリングされ、核酸代謝における酵素の活性を検出するための放射性基質として使用できます。

参考文献

1. Fowler, J.D., Suo, Z. Biochemical, structural, and physiological characterization of terminal deoxynucleotidyl transferase. Chem. Rev, 2006, 106:2092−2110.
2. Loc’h, J., Delarue, M. Terminal deoxynucleotidyltransferase: the story of an untemplated DNA polymerase capable of DNA bridging and templated synthesis across strands. Curr Opin Struct Biol, 2018, 53:22-31.
3. Motea, E.A., Berdis, A.J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: the story of a misguided DNA polymerase. Biochim Biophys Acta, 2010, 1804(5): 1151–1166.