NALase

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序論

アルドラーゼは炭素—炭素結合の形成または開裂を触媒し、多くの代謝経路にその例が見られる。基本的なアルドール反応は、アルデヒド（アルドール受容体）とケトン（アルドール供与体）の縮合により新たな炭素—炭素結合を形成する反応である。一般に、アルドラーゼは触媒において高い立体選択性を示し、新規炭素—炭素結合の形成と同時に最大2つの新規不斉中心の立体配置を制御し得る。この過程では複雑な保護基を必要とせず、同時にアルドール縮合の立体選択性を制御できることから、アルドラーゼファミリーはバイオ触媒として重要な酵素群である。現在、多くのアルドラーゼが、化学合成における有用性向上を目的として、タンパク質工学および指向性進化研究により解析・改変されている。

N-アセチル-d-ノイラミン酸リアーゼ（NALase）（EC 4.1.3.3）はピルビン酸依存性アルドラーゼであり、N-アセチル-d-マンノサミン（ManNAc）とピルビン酸との可逆的なアルドール縮合を触媒して、N-アセチル-d-ノイラミン酸（Neu5Ac）を生成する。NALaseはクラスIアルドラーゼファミリーに属し、順序型Bi-Uniアルドール縮合の速度論的機構（スキーム1）に従う。すなわち、まずピルビン酸がシッフ塩基として結合し、続いてManNAcが結合する。その後のアルドール付加によりシッフ塩基結合型Neu5Acが生成し、これが加水分解されてNeu5Acが遊離する。 

図1. NALaseの一般的反応機構（Daniels, A.D. et al.2014）

長年の研究により、基質および基質アナログが結合した状態を含むNALaseの三次元構造が結晶学的研究で決定されているが、これら低エネルギーで安定な状態間の遷移過程は明らかにされていない。高エネルギーの遷移状態に関する構造情報を結晶学で取得することはほぼ不可能である一方、計算モデリングによりこの情報を得ることができる。特に量子力学／分子力学（QM/MM）法は酵素反応のモデリングにおいて極めて有用である。

QM/MMモデリング

in silicoでAla137をTyrに戻す変異導入後、サブユニットCにおいてピルビン酸およびManNAcが結合した構造を、反応機構のQM/MMモデリングの出発点として用いた。初期段階として、研究者らはd(CC)に沿ってQM/MMアンブレラサンプリング分子動力学（MD）シミュレーションを実施した。QM領域にはManNAc、ピルビン酸—シッフ塩基、およびTyr137側鎖を含め、5系列のアンブレラサンプリングシミュレーションを行った。いずれの条件でも、Tyr137の水酸基プロトンが自発的にManNAcのアルデヒド酸素へ移動し、最終構造としてNeu5Ac–Lys165シッフ塩基が生成した。

アンブレラサンプリングから得られた自由エネルギープロファイルより、中間体のエネルギーは遷移状態より約4～8 kcal mol^-1 低いことが示された。本反応の自発性および自由エネルギーが有意に低い中間体の存在は、野生型NALase反応においてTyr137がプロトン供与体であることを示唆し、従来の推測と整合する。

シミュレーションでは、水分子がしばしば当該位置から離れる一方で、Tyr137からManNAcアルデヒド酸素へのプロトン移動は従前どおり生じた。したがって、水分子は反応に直接関与しないと考えられる。しかし、Lys165と基質／生成物間のシッフ塩基分解過程には水が必要であり、同時にTyr137フェノラートの再プロトン化にも利用され得る。MD軌跡解析では、ピルビン酸炭素への攻撃はほぼ常にsi 面から起こり、炭素原子同士が近接するほどこの選好性がより顕著となった。従って、本シミュレーションは、野生型NALaseにおけるManNAcの結合様式が、報告されている高い立体選択性の主要因であることを強く示唆する。

図2. Tyr137をプロトン供与体とした場合の、ManNAcとピルビン酸–Lys165シッフ塩基間の炭素—炭素結合形成に関するQM/MMポテンシャルエネルギープロファイル（Daniels, A.D. et al.2014）

酵素機構および変異導入

上記で示した結晶構造およびQM/MMシミュレーションデータに基づき、ManNAcとピルビン酸間の炭素—炭素結合形成の詳細機構を提案できる。

図3. ピルビン酸およびManNAc存在下におけるY137A変異体の結晶構造とQM/MMモデリングに基づく、NALase触媒における炭素—炭素結合形成およびプロトン化の機構（Daniels, A.D. et al.2014）

Lys165とのシッフ塩基複合体にあるピルビン酸のエナミン型が、ManNAcアルデヒドのsi 面を攻撃してNeu5Acを形成する。（元）ManNAcアルデヒド酸素周辺の電子密度増加（アルデヒド炭素周囲に生じる正四面体配座に起因）は、Thr167およびTyr137の水酸基からの水素結合により安定化される。炭素—炭素結合形成後、（元）ManNAcアルデヒド酸素はTyr137水酸基によりプロトン化される。QM/MMエネルギー解析は、Tyr137フェノラートを伴うこのNeu5Acシッフ塩基中間体が非常に安定であることを示している。

Tyr137の2種の変異体（Y137AおよびY137F）は活性に有害な影響を及ぼす。これは、Tyr137がManNAcとピルビン酸間の炭素—炭素結合形成において不可欠な役割を担うためであることが、現在では確認されている。変異導入の結果はまた、（元）アルデヒド酸素への水素結合形成により遷移状態を安定化するThr167の重要性も裏付けた。Tyr110'については、活性部位から最も遠位に位置する三者（トライアド）のアラニン置換によりkcat/Kmが有意に低下（40倍）した一方、より嵩高いフェニルアラニンへの置換では速度論的特性に有意な変化は認められなかった。