NALase

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はじめに

アルドラーゼは炭素-炭素結合の形成または切断を触媒し、多くの代謝経路に例が見られます。基本的なアルドール反応は、アルデヒド（アルドール受容体）とケトン（アルドール供与体）の縮合を含み、新しい炭素-炭素結合を形成します。一般的に、アルドラーゼは触媒作用において非常に立体選択的であり、新しい炭素-炭素結合を形成する際に最大2つの新しいキラル中心の配置を制御できます。このプロセスでは、複雑な保護基を必要とせず、同時にアルドール縮合の立体選択性が制御されるため、アルドラーゼファミリーはバイオ触媒として重要な酵素群となっています。現在、多くのアルドラーゼが研究され、化学合成における有用性を向上させるために、タンパク質工学や指向進化研究で修飾されています。

N-アセチル-d-ニュラミン酸リラーゼ（NALase）（EC 4.1.3.3）は、ピルビン酸依存性のアルドラーゼであり、N-アセチル-d-マンノサミン（ManNAc）とピルビン酸の間の可逆的なアルドール縮合を触媒してN-アセチル-d-ニュラミン酸（Neu5Ac）を生成します。NALaseはクラスIアルドラーゼファミリーの一員であり、秩序あるBi-Uniアルドール縮合動力学メカニズム（スキーム1）に従い、ピルビン酸が最初にシッフ塩基として結合し、その後にManNAcが結合します。アルドール付加により、シッフ塩基結合のNeu5Acが生成され、その後加水分解されてNeu5Acが放出されます。 

図1. NALaseの一般的な反応メカニズム（Daniels, A.D. et al.2014）

長年の努力の結果、結晶学的研究により、結合した基質および基質類似体を含む三次元NALase構造が決定されましたが、これらの低エネルギー安定状態間の遷移プロセスは明らかにされていません。結晶学を通じて高エネルギー遷移状態の構造データを取得することはほぼ不可能ですが、この情報は計算モデリングを通じて得ることができ、特に量子力学/分子力学（QM/MM）法は酵素反応のモデリングにおいて非常に優れています。

QM/MMモデリング

in silicoでAla137をTyrに戻した後、サブユニットCに結合したピルビン酸とManNAcの構造が反応メカニズムのQM/MMモデリングの出発点として使用されました。最初に、研究者たちはd(CC)に沿ったQM/MMアンブレラサンプリング分子動力学（MD）シミュレーションを実施しました。ManNAc、ピルビン酸-シッフ塩基、およびTyr137側鎖がQM領域に含まれ、5系列のアンブレラサンプリングシミュレーションが実施されました。すべてのケースにおいて、Tyr137の水酸基プロトンは自発的にManNAcアルデヒド酸素に移動し、最終構造でNeu5Ac-Lys165シッフ塩基が生成されます。

アンブレラサンプリングから得られた自由エネルギープロファイルによれば、中間体のエネルギーは遷移状態よりも約4-8 kcal mol^-1 低いです。この反応の自発性と著しく低い自由エネルギー中間体は、Tyr137が野生型NALase反応におけるプロトン供与体であることを示しており、これは以前の推測と一致しています。

シミュレーションでは、水分子がこの位置からしばしば移動し、Tyr137からManNAcアルデヒド酸素へのプロトン移動が以前と同様に発生します。したがって、水分子は反応に直接参加しないはずです。しかし、Lys165と基質/生成物間のシッフ塩基分解プロセスには水が必要であり、これがTyr137フェノールを再プロトン化するためにも使用される可能性があります。MD軌道解析は、ピルビン酸炭素への攻撃がほぼ常にsi 面で行われ、この好みは炭素原子が互いに近づくにつれてより顕著になることを示しています。したがって、シミュレーションは、野生型NALaseにおけるManNAc結合モードが報告された高い立体選択性の主な寄与因子であることを強く示唆しています。

図2. ManNAcとピルビン酸-Lys165シッフ塩基間の炭素-炭素結合形成のためのQM/MMポテンシャルエネルギープロファイル、Tyr137をプロトン供与体として（Daniels, A.D. et al.2014）

酵素メカニズムと変異原性

上記で紹介した結晶構造とQM/MMシミュレーションデータに基づいて、ManNAcとピルビン酸間の炭素-炭素結合形成の詳細なメカニズムを提案できます。

図3. NALase触媒中の炭素-炭素結合形成とプロトン化のメカニズム、ピルビン酸とManNAcの存在下でのY137A変異体の結晶構造およびQM/MMモデリングから導出（Daniels, A.D. et al.2014）

ピルビン酸のエナミン形態がLys165とシッフ塩基複合体を形成し、ManNAcアルデヒドのsi 面を攻撃してNeu5Acを形成します。アルデヒド炭素の周りに現れる四面体構造による（以前の）ManNAcアルデヒド酸素の周りの電子密度の増加は、Thr167およびTyr137の水酸基からの水素結合によって安定化されます。炭素-炭素結合が形成されると、（以前の）ManNAcアルデヒド酸素はTyr137の水酸基によってプロトン化されます。QM/MMエネルギーは、このTyr137フェノールを持つNeu5Acシッフ塩基中間体が非常に安定であることを示しています。

Tyr137の2つの変異体（Y137AおよびY137F）は活性に有害な影響を与えます。これは、Tyr137がManNAcとピルビン酸間の炭素-炭素結合形成に重要な役割を果たしているためであることが確認されています。変異原性の結果は、（以前の）アルデヒド酸素に水素結合を形成することによって遷移状態を安定化するためのThr167の重要性も確認しました。Tyr110'の場合、活性部位から最も遠い三重項のアラニンへの置換はkcat/Kmを40倍も大幅に減少させましたが、より大きなフェニルアラニンへの置換は動力学に大きな変化を引き起こしませんでした。