ルシフェラーゼ

ルシフェラーゼは、光タンパク質とは異なり、生物発光を放出する酸化酵素のクラスを指す一般的な用語であり、顕微鏡用のバイオテクノロジーや蛍光タンパク質と同様の多くのアプリケーションのレポータージーンとして広く使用されています。しかし、ルシフェラーゼは外部光源を必要とする蛍光タンパク質とは異なり、消費可能な基質ルシフェリンの追加が必要です。異なる動物種のルシフェラーゼは、光の放出に固有の変動を示し、細胞生存率、in vivoイメージング、単一および二重スペクトルのルシフェラーゼレポータアッセイなどのマルチプレックス分析で2つ以上のルシフェラーゼ酵素を組み合わせて使用することができます。

さらに、ルシフェラーゼ反応はフラッシュまたはグローの動力学を含むと考えられており、特定の検出感度と耐久性のある放出時間を持ち、異なる実験目的に耐えることができます。ルシフェラーゼは、ほとんどの細胞が発光しないため、高い信号対雑音比を達成する独自の利点を持ち、サンプリングや調査中のシステムを攪乱することなく、高い時間的解像度と再現性でプロモーター活性を決定するための発現研究に使用される特に多用途なレポータタンパク質です。しかし、ルシフェラーゼレポータが発光を誘発するために分子酸素を必要とすることは、必須嫌気性細菌にレポータとして適用することを本質的に妨げる制限です。ホタルおよび細菌のルシフェラーゼによって触媒される反応におけるエネルギーATPおよび還元フラビンモノヌクレオチド（FMNH₂）の影響は、代謝研究におけるプロモーター活性の測定または分析を複雑にする可能性があります。

古典的な例

さまざまな生物は、さまざまな光を放出する反応を通じて異なるルシフェラーゼで光の生成を管理しています。最も研究されているルシフェラーゼは、ホタルを含む動物や、クラゲ、コペポーダ、海パンジーなどの海洋動物に存在し、発光菌類や他の界の生物、例えば発光細菌にも見られます。ホタルおよび細菌のルシフェラーゼは一般的に利用されています。

ホタルルシフェラーゼは、ルシフェリンを基質として利用し、分子酸素とATPを使用してそれをオキシルシフェリンに酸化し、560 nmで光を放出します。2000種以上を含むホタルのルシフェラーゼは非常に多様で、分子系統学で広く使用されています。ホタルに必要な酸素は、腹部の腹部気管と呼ばれる管を通じて供給されます。Photinus pyralisホタルのルシフェラーゼはよく研究されており、pH 7.8で最適な活性を持っています。

luxCDABEオペロンによってコードされる細菌ルシフェラーゼは通常、Vibrio harveyi、Vibrio fischeri、またはPhotorhabdus luminescensから得られ、還元フラビンモノヌクレオチドとミリスチルアルデヒドをそれぞれミリスチン酸とフラビンモノヌクレオチド（FMN）に酸化することができ、490 nmの波長で光を放出します。細菌の生物発光は、Vibrio fischeri、Vibrio haweyi、およびVibrio harveyiで観察されます。一部の生物発光細菌は、ルシフェラーゼの一次励起状態からエネルギーを受け取るために「アンテナ」を利用して光を放出し、他の細菌ではFMNを含む黄色蛍光タンパク質がルシフェラーゼからの光と比較して赤方偏移した光を放出する色素として扱われます。

使用するルシフェラーゼのタイプ選択は、ホタル酵素が外因性のデカナール基質の追加を含むのに対し、細菌ルシフェラーゼはオペロンにluxCDEを含めることで基質を内因的に生成できるように設計できることを考慮する必要があります。リアルタイムでのプロモーター活性の決定に対するルシフェラーゼの適合性は、酵素の不安定性に依存します。

反応のメカニズム

すべてのルシフェラーゼは酸化還元酵素群に分類され、分子酸素の取り込みを伴う単一のドナーに作用することを示しています。ルシフェラーゼは無関係な種の多様性を持つため、これまでのところ統一されたメカニズムは elaborated されていませんが、多くのメカニズムはルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせに存在します。さらに、これまでに特徴づけられたすべてのルシフェラーゼ-ルシフェリン反応は、ある段階で分子酸素を必要とします。

細菌ルシフェラーゼによって触媒される酸化プロセスは、次の手順で確認されています。

ここで、還元フラビンモノヌクレオチドが長鎖脂肪アルデヒドを脂肪酸に酸化します。反応で生成される励起ヒドロキシフラビン中間体はさらに脱水され、青緑色の光を放出するFMNを生成します。反応に投入されたエネルギーのほぼすべては、80%から90%の変換効率で光に変換されます。

応用

遺伝子工学は通常、さまざまな目的のためにルシフェラーゼを生成するためにラボで適用されます。マウス、蚕、ジャガイモなどのいくつかの生物は、ルシフェラーゼ遺伝子と相互作用してタンパク質を得るために組み込まれています。酸化還元プロセス中に適切なルシフェリン基質に対するルシフェラーゼの作用は、修正された光学顕微鏡やルミノメーターなどの光感受性装置によって感知できる光を放出する可能性があり、生物学的プロセスの観察を可能にします。ルシフェラーゼの生物発光は光励起を必要としないため、自家蛍光や実質的に背景のない蛍光は無視でき、したがって0.02pgのような少量のサンプルでも標準シンチレーションカウンターを通じて正確に測定できます。

生物学的研究におけるルシフェラーゼは、関心のあるプロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を導入された細胞における転写効率を評価するためのレポータとして一般的に機能します。プロルミネセント分子は、特定の酵素を介してルシフェリンに変換された後、共同または二段階のルシフェラーゼアッセイにおける酵素活性の検出に適用される可能性があります。熱感受性タンパク質の保護能力をテストするために、ルシフェラーゼはタンパク質変性調査にも使用できます。

細胞生存率やキナーゼ活性の評価において、ルシフェラーゼはATPセンサータンパク質として機能し、バイオチニル化を介して細胞表面にルシフェラーゼを固定化することによって細胞内のATPレベルを決定するためにも利用できます。これにより、ルシフェラーゼは細胞からのATPの流出を監視する能力を持ち、生物発光を通じてATPのリアルタイム放出を効果的に示します。ATP検出の感度を反映するルミネッセンス強度は、タンパク質内の特定のアミノ酸残基の配列を変更することによって強化できます。

ルシフェラーゼを発現するように設計されたさまざまなタイプの細胞は、敏感な電荷結合素子カメラを通じて生きた動物の内部で非侵襲的に視覚化され、腫瘍形成の全過程や動物モデルにおける治療に対する腫瘍の反応を追跡できます。ルシフェラーゼの量に加えて、in vivoイメージングによって測定される信号強度は、血流、細胞内pH、D-ルシフェリンの吸収、利用可能な補因子、細胞膜透過性、上層組織の透明度など、他のさまざまな要因とも関連している可能性があります。

参考文献