Fpgタンパク質

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Fpgの生化学

Fpg（EC 3.2.2.23）は、8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ（8-oxoguanine-DNA glycosylase）またはMutMとしても知られ、細菌の塩基除去修復（BER）経路における最も重要な酵素の一つである。Fpgは、エネルギー的に有利なsyn配座を取りやすく、その結果アデニンとHoogsteen型塩基対を形成する傾向のある8-オキソグアニン（8-oxoG）の蓄積からDNAを保護する。複製時に8-oxoGの対向にdAMPが取り込まれると、G→Tトランスバージョンが生じる。Fpgは複数の酵素活性を有し、損傷塩基の除去を担うグリコシラーゼ/APリアーゼとして機能した後、β脱離により損傷部位でDNA骨格を切断する。

しかしFpgは、他の多くのグリコシラーゼ/APリアーゼとは異なり、連続する2段階の脱離反応（区別のためしばしば「β脱離」および「δ脱離」と呼ばれる）を実行できる。したがって、Fpg作用の最終産物は、両側を2つのリン酸基に挟まれたDNA中の1ヌクレオチド欠損（ギャップ）である。さらにFpgはデオキシリボホスホジエステラーゼ-リアーゼとしても作用し、DNA中のニックを有するアバシック（AP）部位からデオキシリボース-5’‐リン酸（dRP）を除去する反応を触媒する。この触媒反応の中間体として、酵素と損傷ヌクレオチドのC1’との間に共有結合性イミン（シッフ塩基）が形成され、これはホウ化ナトリウムにより還元されて安定な共有結合性Fpg-DNA複合体を形成し得る。8-oxoGおよびFaPy損傷に加え、Fpgは他の多くの修飾プリン、ならびに一部の酸化ピリミジンも切除する可能性がある。

異なる細菌種由来Fpgタンパク質の構造

現在、E. coli（Eco-Fpg）、Lactococcus lactis、Bacillus stearothermophilus、およびThermus thermophilus由来のFpgタンパク質について構造データが利用可能である。Th. thermophilusのFpgは非複合体タンパク質として解かれている一方、他のFpgタンパク質はDNA結合状態で解析されているが、これらのタンパク質構造は全体として非常に類似していた。

Fpgは、ヒンジとなるポリペプチドにより連結されたN末端ドメインおよびC末端ドメインから構成される。N末端ドメインにはシッフ塩基形成のための活性部位が存在し、Pro-1が求核剤として作用する。C末端ドメインには、損傷DNA結合に必要な単一の亜鉛フィンガーが含まれる。図1に、X線データに基づくFpg-DNA相互作用の模式図を示す。

他の多くのDNAグリコシラーゼと同様に、Fpgは損傷ヌクレオチドをDNAから反転（フリップアウト）させ、深い活性部位ポケットへ取り込む。孤立した対向シトシン残基（C⁽⁰⁾）を認識するため、酵素はPhe-110のアリール環をC⁽⁰⁾と隣接塩基（C⁽¹⁾）の間の空間に楔入し、C⁽¹⁾のピリミジン環と面対面の相互作用を形成することで、2つの塩基のスタッキングを解消する。C⁽⁰⁾は二重らせん内に留まり、C⁽⁰⁾とArg-108のO²およびN3との間の水素結合により安定化される。

図1. Fpg-DNA相互作用の模式図（Zharkov, D.O. et al. 2003）

DNAの構造要素がFpg結合に与える寄与

Fpgにより誘導される、触媒的に最適な配座への非特異的なDNA調整は、ストップトフロー実験では検出できなかった。多くのDNA依存性酵素において、この調整およびそれに続く触媒段階はDNAの性質に最も敏感である。各酵素は独自の方法でDNA配座を微調整し、しばしばDNA断片の融解を伴い、DNA骨格の配座変化や塩基の部分的または完全なアンスタッキングを伴うことが多い。酵素と特定のDNA塩基との間で構造的に規定された水素結合が形成されることは、基質選択の最終段階の一つである。これらの結合の形成により、酵素活性部位における特定塩基の適切な配向が保証され、反応速度は10⁴～10⁷倍加速される。

非特異的二本鎖ODNから特異的二本鎖ODNへの移行に伴う親和性の増加は、ある程度DNA配列に依存する。特異的ヘテロODNに対する親和性は、d(pT)_14-15•d(pA)_14-15に対する親和性より50～75倍高い。Fpgと8-oxoGとの特異的相互作用の相対的寄与は、（最小リガンド、一本鎖および二本鎖ODNのいずれにおいても）すべてのレベルで同程度であり、DNAの個々のヌクレオチドによる特異的および非特異的相互作用の総親和性への寄与が、ほぼ加算的であることを示唆する。Fpgは遊離dNMPを、その構造要素との基本的な加算的相互作用を通じて認識し、その主要な寄与はリン酸部分に由来する。原理的には、dNMPの異なる構造要素を近似するリガンド間で絶対的な加算性が成立するとは限らない。Fpgは、DNA内のモノヌクレオチド単位および遊離dNMPの双方を、ほぼ加算的に、かつ同程度の親和性で認識できる。要約すると、特異的DNAに対するFpgの相互作用は、図2に示すモデルにより近似できる。

図2. 特異的DNAに対するFpg相互作用の熱力学モデル（Zharkov, D.O. et al. 2003）