Fpgタンパク質

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Fpgの生化学

Fpg (EC 3.2.2.23)、別名8-オキソグアニン-DNAグリコシラーゼまたはMutMは、細菌のBER経路において最も重要な酵素の一つです。Fpgは、エネルギー的に有利なシス構造を採りやすい8-オキソグアニン（8-oxoG）からDNAを保護します。複製中に8-oxoGの対にdAMPが追加されると、G→Tの転移が生じます。Fpgは複数の酵素活性を持ち、損傷した塩基の除去を担当するグリコシラーゼ/APリアーゼとして機能し、その後、β-脱離によって損傷部位でDNA骨格を切断します。

しかし、Fpgはほとんどの他のグリコシラーゼ/APリアーゼとは異なり、2つの連続した脱離ステップ（しばしば「β-脱離」と「δ-脱離」と呼ばれる）を実行する能力を持っています。したがって、Fpgの作用の最終生成物は、2つのリン酸基に挟まれたDNA内の単一ヌクレオチドギャップです。さらに、Fpgはデオキシリボース-5'-リン酸をDNAの切断されたアバシック（AP）部位から除去するデオキシリボホスホジエステラーゼ-リアーゼとしても機能します。この触媒反応の中間体として、酵素と損傷したヌクレオチドのC1'の間に共有結合イミン（シッフ塩基）が形成され、ナトリウムボロハイドライドで還元されて安定した共有結合Fpg-DNA複合体が形成されます。8-oxoGおよびFaPy損傷に加えて、Fpgは他の多くの修飾されたプリンやおそらくいくつかの酸化されたピリミジンも切除しました。

異なる細菌種のFpgタンパク質の構造

現在、E. coli（Eco-Fpg）、Lactococcus lactis、Bacillus stearothermophilus、およびThermus thermophilusからのFpgタンパク質の構造データが利用可能です。Th. thermophilus Fpgは非複合体タンパク質として解明され、他のFpgタンパク質はDNAに結合した状態で分析されましたが、これらのタンパク質構造は全体的に非常に似ていました。

Fpgは、ヒンジポリペプチドによって接続されたN末端およびC末端ドメインで構成されています。N末端ドメインにはシッフ塩基形成のための活性部位が含まれており、Pro-1がヌクレオフィルとして機能します。C末端ドメインには、損傷したDNAに結合するために必要な単一の亜鉛フィンガーが含まれています。図1は、X線データからのFpg-DNA相互作用の概略図を示しています。

ほとんどの他のDNAグリコシラーゼと同様に、Fpgは損傷したヌクレオチドをDNAから深い活性部位ポケットに反転させます。孤立した対向するシトシン残基（C⁽⁰⁾）を認識するために、酵素はPhe-110のアリール環をC⁽⁰⁾と隣接する塩基（C⁽¹⁾）の間の空間に押し込み、C⁽¹⁾のピリミジン環との面対面相互作用を行い、2つの塩基をスタッキングから外します。C⁽⁰⁾はヘリックス内に留まり、C⁽⁰⁾とArg-108のO²およびN3との間の水素結合によって安定化されます。

図1. Fpg-DNA相互作用のスキーム（Zharkov, D.O. et al. 2003）

Fpg結合に対するDNAの構造要素の寄与

Fpgによる非特異的DNAの調整が触媒的に最適な構造に対して停止流実験で検出されませんでした。多くのDNA依存性酵素にとって、この調整とその後の触媒ステップはDNAの性質に最も敏感です。各酵素は、DNA断片のメルティングを伴うことが多く、DNA骨格の構造変化や部分的または完全な塩基のアンパッキングを含む独自の方法でDNAの構造を微調整します。酵素と特定のDNA塩基との間に構造的に定義された水素結合が形成されることは、基質選択の最終段階の一つです。これらの結合の形成は、酵素の活性部位における特定の塩基の適切な向きを確保し、反応を4-7桁のオーダーで加速します。

非特異的から特異的ds ODNへの遷移における親和性の増加は、ある程度DNA配列に依存します。特定のヘテロODNに対する親和性は、d(pT)_14-15•d(pA)_14-15に対する親和性の50-75倍高いです。Fpgと8-oxoGとの特異的相互作用の相対的寄与は、すべてのレベル（最小リガンド、ssおよびds ODN）で比較可能であり、DNAの個々のヌクレオチドの特異的および非特異的相互作用がFpgに対する全体的な親和性にほぼ加算的であることを示唆しています。Fpgは、構造要素との基本的な加算的相互作用を通じて自由なdNMPを認識し、リン酸基が主要な寄与を果たします。原則として、dNMPの異なる構造要素に近似するリガンドに対して絶対的な加算性は期待されません。Fpgは、DNA内のモノヌクレオチドユニットと自由なdNMPをほぼ加算的な方法で認識し、比較可能な親和性を持っています。要約すると、Fpgと特定のDNAとの相互作用は、図2に示すモデルを使用して近似できます。

図2. 特定のDNAとのFpgの相互作用の熱力学モデル（Zharkov, D.O. et al. 2003）