AlaDH

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アラニン脱水素酵素（Alanine dehydrogenase：AlaDH）は、現在、バイオテクノロジー、食品、医薬品などの各種分野で利用されている。AlaDH（EC 1.4.1.1）の系統名はL-アラニン：NAD⁺酸化還元酵素（脱アミノ化）であり、酸化的脱アミノ化の過程で電子受容体であるNAD⁺/NADP⁺を還元することから、酸化還元酵素に分類される。AlaDHはWiameおよびPierardによりBacillus subtilisで初めて見出された。その後、さまざまな微生物において、本酵素の速度論的特性および触媒反応の律速段階が報告されている。アラニン脱水素酵素は、微生物で一般的に産生されるグルタミン酸脱水素酵素とは異なり、広く普遍的に産生されるわけではなく、主としてBacillus属に多く認められる。

AlaDHをコードする遺伝子はald（alaD）と呼ばれる。M. tuberculosisのald遺伝子は、E. coliで発現させるとピルビン酸のアミノ化活性を示す。一方、M. tuberculosisにおいてald遺伝子を不活化すると、AlaDH機能が失われる。B. subtilisでは、aldRは転写活性化因子であり、ald発現を媒介し、胞子形成に重要である。Rhizobium leguminosarumでは、aldRの変異によりald活性の誘導が阻害される。したがって、aldRはald遺伝子の誘導に必須であり、L-アラニンの存在／非存在に応じて、活性化因子または抑制因子として機能し得る。DNase Iフットプリント解析により、M. smegmatisのald遺伝子上流95 bpに、4つのaldR結合部位（O2、O1、O4、O3）が同定された。O2、O1、O4はアラニンによるald発現誘導に必要であり、O3はald発現の抑制に直接関与する。研究により、アラニン存在下では転写調節因子aldRが四次構造をホモ二量体から開環型コンフォメーションを有する八量体へと変化させることが示されている。

図1．AlaDHが触媒する正反応および逆反応（Dave, U.C; Kadeppagari, R.K. 2019）

酸化的脱アミノ化活性

AlaDHは正反応においてL-アラニンからアミノ基を除去し、その後、炭素骨格（ピルビン酸）はクエン酸回路により分解され得る。AlaDHの役割は、胞子形成に必要なエネルギー源としてのピルビン酸を供給することである。

還元的アミノ化活性

取り込まれたピルビン酸およびアンモニウムは、AlaDHによりL-アラニンへ代謝される。in vivoにおけるAlaDHの主要機能はピルビン酸の還元的アミノ化であり、ペプチドグリカン合成に用いられるアラニンの産生に寄与する。L-アラニンは、ペプチドグリカンの反復ペプチドサブユニットを構成する3つの必須アミノ酸の一つであるため、AlaDHは（Streptomyces aureofaciensなど）微生物の細胞壁骨格の合成において重要な役割を担う。さらに、L-アラニンは多くの重要な既知タンパク質にしばしば含まれることから、細菌細胞質におけるタンパク質合成においても重要である。

図2．正反応におけるL-アラニンの酸化的脱アミノ化および逆反応におけるピルビン酸の還元的アミノ化による、微生物におけるAlaDHの機能（Dave, U.C; Kadeppagari, R.K. 2019）

NAD⁺/NADHの維持

AlaDHはNAD⁺プールの維持にも重要な役割を果たす。M. tuberculosisのaldノックアウト変異株は、in vitroでの嫌気生存性を低下させなかったが、再酸素化後の増殖再開が有意に遅延した。再活性化過程において当該変異株のNADH/NAD⁺比が変化したことから、嫌気条件下で最適なNADH/NAD⁺比を維持するためにAlaDHが必要であることが示唆される。AlaDHは、休眠／低酸素状態にあるM. tuberculosisにおいて酸化還元バランス（NADH/NAD⁺）を維持し、酸素レベルがM. tuberculosisの再生を支持できる程度まで上昇すると、回復／再活性化を促進する。

グリオキシル酸還元的アミナーゼ活性

さらに、一部の微生物では、aldが二機能性AlaDHをコードする。PvRA（ピルビン酸還元的アミナーゼ活性）はピルビン酸のアラニンへの還元を触媒し、GxRA（グリオキシル酸還元的アミナーゼ活性）はグリオキシル酸をグリシンへ変換するとともにNADHをNAD⁺へ酸化する。AlaDHは多様な細菌から同定されているが、すべての酵素がGxRA活性を有するわけではなく、これは当該酵素群に大きな配列多様性が存在することに起因する可能性がある。Mycobacterium tuberculosisにおけるAlaDHの二重機能は、生化学的および遺伝学的手法により確認されている。M. tuberculosisでaldを不活化すると、PvRAおよびGxRAの両活性が低下または消失する。さらに、クローニングしたaldコピーをゲノムに挿入すると機能が回復した。また、基質としてピルビン酸またはグリオキシル酸を用いた場合、E. coliから精製したヒスチジンタグ付加タンパク質がこれら2つの反応を触媒する。

図3．AlaDHが触媒する反応（Dave, U.C; Kadeppagari, R.K. 2019）