AlaDH

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アラニン脱水素酵素（AlaDH）は、現在、バイオテクノロジー、食品、製薬などのさまざまな用途で使用されています。AlaDH（EC1.4.1.1）の系統名はL-アラニン: NAD⁺ 酸化還元酵素（脱アミノ化）であり、酸化還元酵素に属します。これは、酸化的脱アミノ化の過程で電子受容体NAD⁺/NADP⁺を還元するためです。AlaDHは、最初にWiameとPierardによってBacillus subtilisで発見されました。その後、酵素の動力学的特性と触媒制限ステップがさまざまな微生物で発表されました。アラニン脱水素酵素は、グルタミン酸脱水素酵素とは異なり、微生物で一般的に生成されることはなく、主にBacillus種に存在します。

AlaDHをコードする遺伝子はald (alaD)と呼ばれています。M. tuberculosisのald 遺伝子は、E. coliで発現するとピルビン酸アミン化活性を持ちます。しかし、M. tuberculosisでald 遺伝子が不活化されると、AlaDH機能の喪失を引き起こします。B. subtilisでは、aldRは転写活性化因子であり、ald の発現を媒介し、胞子形成に重要です。Rhizobium leguminosarumでは、aldRの変異がald 活性の誘導を妨げます。したがって、aldRはald 遺伝子の誘導に必要であり、aldRはL-アラニンの有無に応じて活性化因子または抑制因子として機能します。DNase Iフットプリント分析を通じて、M.smegmatisのald 遺伝子の95 bp上流に4つのaldR結合部位（O2、O1、O4、O3）が特定されました。O2、O1、およびO4はアラニンによるald発現の誘導に必要であり、O3はald 発現の抑制に直接関与しています。研究により、アラニンの存在下で転写調節因子aldRがホモ二量体からオクタマーの開環構造に四次構造を変化させることが示されています。

図1. AlaDHによる前進反応と後退反応 (Dave, U.C; Kadeppagari, R.K. 2019)

酸化的脱アミノ化活性

AlaDHは、L-アラニンからアミノ基を除去する前進反応を触媒し、その後、クエン酸回路によって炭素骨格（ピルビン酸）を分解します。AlaDHの役割は、胞子形成に必要なエネルギー源としてピルビン酸を提供することです。

還元的アミン化活性

ピルビン酸と取り込まれたアンモニウムは、AlaDHによってL-アラニンに代謝されます。AlaDHの主な機能はin vivoでのピルビン酸の還元的アミン化であり、これはアラニンを生成してペプチドグリカンを合成するために使用されます。AlaDHは、L-アラニンがペプチドグリカンの繰り返しペプチドサブユニットを構成する3つの必須アミノ酸の1つであるため、微生物（例えばStreptomyces aureofaciens）の細胞壁骨格の合成に重要な役割を果たします。L-アラニンは多くの重要な既知のタンパク質にしばしば存在するため、細菌の細胞質におけるタンパク質合成にも重要な役割を果たします。

図2. 前進反応におけるL-アラニンの酸化的脱アミノ化と後退反応におけるピルビン酸の還元的アミン化による微生物におけるAlaDHの機能 (Dave, U.C; Kadeppagari, R.K. 2019)

NAD⁺/NADHの維持

AlaDHは、NAD⁺プールの維持にも重要な役割を果たします。M. tuberculosisのaldノックアウト変異体は、in vitroでの嫌気的生存を減少させませんでしたが、再酸素化後の成長の再開に著しい遅延を引き起こしました。再活性化プロセス中に、変異体のNADH/NAD⁺比が変化し、これはAlaDHが嫌気的状態の間に最適なNADH/NAD⁺比を維持するために必要であることを示しています。AlaDHは、M. tuberculosisの休眠/低酸素状態において酸化還元バランス（NADH/NAD⁺）を維持し、酸素レベルがM. tuberculosisの再生を支えるのに十分なほど増加したときに回復/再活性化します。

グリオキシル酸還元的アミン化活性

さらに、aldは一部の微生物において二機能性AlaDHをコードしています。PvRA（ピルビン酸還元的アミン化活性）は、ピルビン酸をアラニンに還元する反応を触媒し、GxRA（グリオキシル酸還元的アミン化活性）はグリオキシル酸をグリシンに変換し、NADHをNAD+に酸化します。AlaDHは多くの種類の細菌から同定されていますが、これらの酵素のすべてがGxRA活性を持っているわけではなく、これはこれらの酵素における大きな配列の多様性の存在による可能性があります。Mycobacterium tuberculosisにおけるAlaDHの二重機能は、生化学的および遺伝的手法によって決定されました。M. tuberculosisにおけるald の不活化は、PvRAおよびGxRAの両方の活性の減少または喪失を引き起こします。この機能は、クローン化されたaldのコピーがゲノムに挿入されたときに回復しました。さらに、ピルビン酸またはグリオキシル酸を基質として使用することで、E. coliから精製されたヒスチジンタグ付きタンパク質がこれらの2つの反応を触媒します。

図3. AlaDHによって触媒される反応 (Dave, U.C; Kadeppagari, R.K. 2019)