リゾチーム（N-アセチルムラミダーゼまたはムラミダーゼとしても知られる）は、構造的および機構的に極めて重要な抗菌酵素の代表的な例です。アレクサンダー・フレミングは1921年にリゾチームを発見し、1960年代半ばにX線結晶構造解析によって初めて特徴づけられました（Phillips, 1965）。リゾチームは、X線回折によって三次元構造が解明された最初の酵素です。その構造、触媒機構、安定性により、リゾチームは酵素学および構造生物学における標準的なモデルとなっています。

Creative Enzymesでは、さまざまな用途に合わせた高品質なリゾチーム製品を幅広く提供しています。本記事では、リゾチームの分子構造とその重要性について詳しくご紹介します。

一次構造と三次構造

一次配列とジスルフィド構造

最も広く研究されている鶏卵白リゾチーム（HEWL）は、129個のアミノ酸からなり、分子量は約14.3 kDaです。6つのトリプトファン（Trp）、3つのチロシン（Tyr）、3つのフェニルアラニン（Phe）残基を含みます。4つのジスルフィド結合（Cys6-Cys127、Cys30-Cys115、Cys64-Cys80、Cys76-Cys94）が、コンパクトで剛直な三次構造を維持しています。

フォールド構造

リゾチームは、2つのドメインからなるコンパクトな球状フォールドをとります。

• αヘリックスドメイン（約1-35および89-129残基）
• βシートドメイン（約36-88残基）

これらのドメインは、ペプチドグリカン鎖を収容する深い触媒クレフトを形成し、6つの糖結合サブサイト（A-F）が並んでいます。酵素は非常にカチオン性（HEWLの等電点は約11.3）であり、生理的pH下で細菌表面への強い静電的引力を促進します。

図1. アンフォールド状態のリゾチームとフォールド状態のリゾチーム。（Dilip et al., 2022）

触媒機構

リゾチームの抗菌機能の核心は、細菌細胞壁ペプチドグリカン内のグリコシド結合を加水分解する能力にあります。特に、リゾチームはβ-1,4グリコシド結合（N-アセチルムラミン酸（NAM）とN-アセチルグルコサミン（NAG）間）を標的とし、これは細菌細胞壁の完全性に不可欠な繰り返し糖単位です。この結合を切断することで、リゾチームは細菌細胞壁の構造的安定性を損ない、最終的に細胞溶解を引き起こします。この活性は、多くの生物における自然免疫の防御機能に不可欠です。

主要な活性部位残基

リゾチームの酵素活性は、活性部位内の2つの重要な触媒残基、グルタミン酸35（Glu35）とアスパラギン酸52（Asp52）によって媒介されます。Glu35は一般的な酸として働き、結合切断時に離脱基の脱離を促進するためにプロトンを供与します。Asp52は求核剤として機能し、オキソカルベニウムイオン様遷移状態を安定化させるか、一時的な共有結合中間体を形成します。基質はAからFまでの6つの明確なサブサイトに結合し、NAM部分は通常サブサイトB、NAG部分はサブサイトAに結合します。この配向により、切断される結合が正確に触媒攻撃に整列します。

反応経路

リゾチームには、Koshland機構とPhillips機構という2つの広く議論されている提案機構があります。

Koshland機構は保持型の二重置換経路を提案します。このモデルでは、Glu35がプロトン供与体としてグリコシド結合の切断を促進し、Asp52がアノマー炭素への求核攻撃を行い、共有結合型グリコシル酵素中間体を形成します。その後、水分子がこの中間体を加水分解し、酵素を元に戻し、糖の立体配置を保持します。

対照的に、Phillips機構は一段階のSN1様プロセスを提案します。ここでは、グリコシド結合が切断され、オキソカルベニウムイオン様遷移状態が生成されます。Asp52がこの正電荷を安定化させ、Glu35が結合切断を助けるためにプロトンを供与します。その後、水分子が求核剤として反応を完了させます。

両機構ともリゾチームの触媒機能への洞察を与えますが、共有結合中間体の検出などの実験的証拠はKoshland機構をより強く支持しています。

図2. リゾチームの2つの可能な機構。

基質認識

リゾチームによる効果的な触媒作用は、活性部位の化学だけでなく、正確な基質認識と配置にも依存します。これは、Trp62、Trp63、Asp101などの残基が関与する水素結合や疎水性スタッキングなど、複数の非共有結合的相互作用によって達成されます。これらの残基は、ペプチドグリカン鎖を活性クレフト内に固定するのに役立ちます。しかし、NAMのO-アセチル化やNAGのN-脱アセチル化など、ペプチドグリカンの化学修飾はこれらの相互作用を妨げる可能性があります。このような修飾は、Staphylococcus aureusなどの細菌がリゾチーム攻撃を回避するために利用しており、重要な耐性機構となっています。

構造多様性と進化

リゾチームファミリー

リゾチームは、さまざまな生物に広く存在する構造的・機能的に多様な酵素群です。配列相同性、構造フォールド、触媒機構に基づき、リゾチームは以下のいくつかのファミリーに分類されます。

• C型（チキン型）リゾチーム：最も広く研究されており、分子量は約14 kDa、脊椎動物に多く存在します。保存されたα/βフォールドを特徴とし、通常グラム陽性菌に対して活性を示します。
• G型（グース型）リゾチーム：これらの酵素は一般に大きく（20–22 kDa）、主に鳥類や爬虫類に見られます。異なるフォールドと触媒機構を持ちながらも、同様の抗菌機能を果たします。
• I型（無脊椎動物型）リゾチーム：より大きな構造的多様性を示し、さまざまな無脊椎動物に存在します。抗菌防御以外にも消化や免疫調節などの役割を持ち、多様な進化的圧力を反映しています。

図3. リゾチームの系統解析。解析に用いたリゾチーム遺伝子名は、種の学名とこの特定遺伝子のGenBankアクセッション番号で示されています。Ostriniaリゾチームは赤で示されています。無脊椎動物c型、脊椎動物c型、i型、g型リゾチームに特異的な枝は、それぞれ黄色、青、緑、オレンジで塗りつぶされています。（Liu et al., 2014）

進化的保存性と分岐

分類群間での分岐があるにもかかわらず、コアとなる触媒構造、特にα/βフォールドと活性部位残基は保存されており、リゾチームが古くから自然免疫で果たしてきた役割を示しています。一方、表面ループの配列変異は基質選択性、安定性、非標準的機能を調節します。

安定性、フォールディング、および生物物理的特性

• 熱安定性およびpH安定性：HEWLは高い熱安定性（pH5で融解温度-72℃まで）を示し、工業用途に最適です。対照的にヒトリゾチームは熱安定性が低く、より低温で失活します。リゾチームは広いpH範囲（pH6-9）で活性を保持します。
• 内在性蛍光と構造解析：6つのトリプトファン残基（特にTrp62とTrp108）は内在性蛍光団として機能し、蛍光分光法や分子動力学シミュレーションによるフォールドダイナミクス、リガンド結合、タンパク質凝集の研究を可能にします。
• アミロイドーシスおよび凝集傾向：不安定化条件下（例：高濃度SDS）では、リゾチームはアミロイド様線維を形成することがあり、全身性アミロイドーシス研究におけるタンパク質凝集モデルとなります。

宿主防御における機能的役割

抗菌活性

リゾチームは、主にグラム陽性菌に対する溶菌活性を発揮することで自然免疫系の中心的役割を担っています。これらの生物は、リゾチームの酵素活性に容易にアクセスできる露出した厚いペプチドグリカン層を持っています。対照的に、グラム陰性菌は追加の外膜を持ち、ペプチドグリカン層を保護しているため、外膜が界面活性剤、抗菌ペプチド、または宿主由来因子によって損なわれない限り、一般的にリゾチームに対してより耐性があります。重要なのは、リゾチームの抗菌効果は、ペプチドグリカン中のβ-1,4グリコシド結合の酵素的切断だけに依存していないことです。触媒活性が低下または阻害されても、リゾチームは負に帯電した細菌表面との静電的相互作用や、細菌自身のオートリシン（細胞壁自己消化酵素）の誘導など、代替機構によって殺菌性を保持します。

免疫調節的相互作用

直接的な抗菌作用に加え、リゾチームは免疫調節にも大きく寄与します。リゾチームによる細菌ペプチドグリカンの酵素分解により、ムロペプチドと呼ばれる小さな断片が放出され、これが細胞内パターン認識受容体（PRRs）、特にNOD1およびNOD2（ヌクレオチド結合オリゴメリゼーションドメイン含有タンパク質）によって認識されます。これらの受容体は、炎症反応、サイトカイン産生、免疫細胞の動員を促進するシグナル伝達カスケードを開始し、感染に対する宿主防御を強化します。さらに、リゾチームは細菌抗原の処理と提示を促進することが示されており、特に粘膜組織で炎症を過度に引き起こすことなくバランスの取れた免疫応答を調整します。この免疫調節機能は、消化管や呼吸器などの粘膜環境での恒常性維持に重要です。

レクチン様結合

酵素活性や免疫シグナル伝達機能を超えて、リゾチームはレクチン様挙動を示し、酵素活性がなくてもリポ多糖（LPS）や莢膜多糖などの細菌表面糖鎖に直接結合できます。この非触媒的結合は、細菌凝集を促進し、免疫認識を高め、宿主免疫細胞による貪食を促進します。このような活性は、病原体がリゾチームの触媒機能を阻害する機構を進化させた場合にも、レクチン様結合が第二の防御線となるため、特に重要です。

構造と機能の関係

• 構造と基質特異性の関係：リゾチームの活性部位クレフトの構造配置（サブサイトA～F）は、ペプチドグリカン鎖が触媒時にどのように収容されるかを決定し、基質特異性を規定します。NAM残基のO-アセチル化など細菌細胞壁の修飾は、立体障害をもたらし、効果的な基質結合を妨げます。これらの修飾は、Staphylococcus aureusなどの病原菌がリゾチームによる分解を回避する主要な耐性機構です。
• 静電表面と非触媒活性：リゾチームは強いカチオン性（正電荷）表面を持ち、特にテイコ酸やリン脂質膜など細菌細胞のアニオン性（負電荷）表面との相互作用を促進します。この静電親和性は結合を高めるだけでなく、膜透過性の増加や内因性細菌オートリシンの活性化など、非酵素的な殺菌効果にも寄与します。これらの特徴は、単なる酵素的加水分解を超えたリゾチームの多機能的な宿主防御役割を強調しています。
• 安定性の構造的決定因子：リゾチームの卓越した構造的堅牢性は、4つのジスルフィドブリッジ、密なヘリックス-シートパッキング、よく制約されたループ領域によって安定化されたコンパクトなα/βフォールドに由来します。これらの特徴により、熱、pH変動、プロテアーゼによる分解などの条件下でも例外的な安定性が付与されます。その結果、リゾチームは多様な環境条件下でも機能を維持し、長期的な活性と安定性が求められる治療、診断、工業用途に適しています。

まとめると、リゾチームは分子レベルの驚異であり、その控えめなサイズの酵素が持つ構造的な優雅さは、細菌壁の切断から免疫応答の調整に至るまで多様な生物学的機能を支えています。酵素学、構造生物学、免疫学、バイオテクノロジーの分野における要石です。

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